199883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadásgátló proteinek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199883 B 2 szemben a tripszin 3 órás inkubációs idó alatt is alig inaktiválja az alvadásgátlót (lásd a 11. ábrát). Az ezekben a kísérletekben használt 1 típusú proteáz és tripszin koncentráció 15 percen belül inaktivál 2,5 nM trombint. Azok az I típusú proteáz és tripszin mennyiségek, amelyeket a reakció keverékekből az MPTT vizsgálatokba viszünk át, nem befolyásolják a kontroll alvadási időt. Az MPTT mind az alvadásgátló anyag jelenlétében (lásd a 12. ábrát), mind a HTP-vel való aktiváláskor és az alvadásnak a Xa faktorral történő megindításakor meghosszabbodik. A trombin által indukált alvadás azonban nem gátolt. Ezeknek a tapasztalatoknak az alapján vizsgáltuk az alvadásgátló anyag hatását a protrombinnak trombinná való átalakulására, amit Xa faktor, Va faktor, foszfolipid és Ca2 + vált ki. Az említett kísérleti feltételek mellett az alvadásgátló szer dózisától függően gátolja a trombin képződését (lásd a 13A, ábrát). Ha V» faktor nélkül, Xa faktorral, foszfolipiddel és Ca2 + ionnal történik a protrombin aktiválása, ezt ugyancsak gátolja az alvadásgátló anyag (lásd a 13B. ábrát). Ez a gátlás azonban nem figyelhető meg akkor, ha az aktiválási foszfolipid nélkül végezzük (lásd a 13C. ábrát). 5. példa VÁC elleni poliklonális antitest Marha VÁC ellen nyulakban termelünk poliklonális antitesteket. A fentiekben leírt módszerrel tisztított marha VAC-t egyenlő arányban keverjük komplett Freund adjuvánssal. A keveréket a nyulaknak szubkután oltjuk be. Négy hét múlva emlékeztető oltás következik, azaz a nyulak újból kapnak tisztított marha VAC-ból szubkután oltást. Ezt a booster-oltást kétszer ismételjük 2 hetenként. Az utolsó booster-oltás utáni 10. napon a nyulakból próbavért veszünk és a vért megalvasztjuk, hogy szérumot kapjunk. A szérumból az immunglobulinokat (lg) a következő séma szerint izoláljuk: a) a szérumot 30 percig 56 °C-on melegítjük; b) a szérumot ezután DEAE-Sephacel-re visszük, amelyet előzőleg 50 mM trisz és 100 mM NaCl tartalmú oldattal (pH = 8,2) ekvilibráltunk; c) a nem kötődött proteineket ammóniumszulfáttal csapjuk ki 50%-os telítés mellett; d) a kicsapott proteineket centrifugálással ülepítjük, az üleucket 50 mM trisz és 100 mM NaCl tartalmú oldatban (pH = 7,9) reszuszpendáljuk, majd ugyanezen pufferrel szemben gondosan kidializáljuk, e) a kapott protein keverék az lg. A marha aortából, marha tüdőből, patkány- és ló aortából, valamint humán köldökzsinór artériából a fent leírt eljárással izolált protein frakciók VÁC aktivitást mutatnak. A proteineket poliakrilamid gélben SDS jelenlétében és nem redukáló körülmények közt elektroforézissel választjuk el. Az elektroforézis befejezésé után a proteineket a gélből nitrocellulóz csíkokra visszük át Towbin és munkatársai szerint (H. Towbin, Th. Staehelin, J. Gordon, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 4350-4354 /1979/]. A csíkokat anti- VAC-lg-vel inkubáljuk, ezután intenzíven mossuk, majd torma-peroxidázhoz kötött kecske anti-nyúl-Ig-vel inkubáljuk. A konjugátumot diamin-benzidin-letrahidrokloriddal (a peroxidáz szubsztrátuma) tesszük láthatóvá. Amikor az eljárást befejeztük, a nitrocellulóz csíkokon egy barna sáv mutatja a kecske anti-nyúl-Ig jelenlétét. Ezenkívül ebben a foltban anti-VAC-Ig és anti-VAC-Ig-t kötő proteinek is megtalálhatók. A marha aortából, marha tüdőből, patkány- és ló aortából, valamint humán köldökzsinór artériából izolált, VÁC aktivitású proteinek immunoblotjail a 14. ábrán mutatjuk be. A fenti eredményekből az alábbi következtetések vonhatók le: a leírt izolálási eljárás alkalmazásával marha aortából, marha tüdőből, patkány- és ló aortából, valamint humán köldökzsinór artériából VÁC aktivitású protein frakció állítható elő. Továbbá az izolált VÁC aktivitású protein frakciók olyan körülbelül 32.000, 34.000 és 70.000 molekulasúylú proteineket tartalmaznak, amelyek anii-VAC-lG-vei (tisztított marha VÁC ellen nyálban termelt 1G) reagálnak. 6. példa A VÁC egy tisztítási lépése nagyvolumenű foszfolipid-vezikula alkalmazásával A nagyvolumenű foszfolipid-vezikulát (LVV, amely PS-ből és PC-ből áll) van de Waart és munkatársai szerint [P. van de Wart, H. Bruis, H.C.Hemker, Th. Lindhout, Biochemistry, 22, 2427-2432 /1983/) állítjuk elő. A tisztítási lépéshez a PS/PC-t (mólaránya = 20:80) tartalmazó LVV-t használjuk. Azonban más mólarányok is használhatók azzal a megszorítással, hogy negatív töltésű foszfolipideknek kell lenniük. A foszfolipidckben a zsírsav láncok hosszúsága szintén változtatható. Eljárás: LVV-t 1 mM foszfolipidet 5 mM triszxHCl és 100 mM NaCl (pH= 7,9) tartalmú pufferben azonos volumenű VÁC aktivitást kifejtő protein frakcióval keverünk össze. A proteineket 50 mM triszxHCl, 100 mM NaCl és 10 mM CaCl2 (pH = 7,9) tartalmú oldatban oldjuk. A keveréket 5 percig szobahőmérsékleten tartjuk, ezután 30 percig 20.000 g mellett centrifugáljuk.Az üledéket 50 mM triszxHCl, 100 mM NaCl és 10 mM CaCl2 (pH = 7,9) tartalmú oldatban reszuszpendáljuk és megint centrifugáljuk. A kapott felülúszó tartalmazza a VÁC aktivitást. A fentiekben leírt módszer a tisztított VÁC előállításának egy igen eredményes tisztítási lépése. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás véralvadásgátló proteinek előállítására, amelyek emlősökből származó erekkel erősen átszőtt szövetekből izolálhatók, a véralvadási faktorokat nem inaktiválják, a foszfolipideket nem hidrolizálják, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
