199883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadásgátló proteinek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199883 B 2 A találmány tárgya eljárás új véralvadásgátló proteinek előállítására. A véralvadásgátló proteineket, amelyek a legtöbb emlősállatban előfordulnak, három csoportba oszthatjuk. A beosztás a proteinek hatásmechanizmusának különbségén alapszik. 1. Az alvadási faktorral komplexet alkotó és ezáltal az alvadási faktort hatástalanító proteinek. Ide tartoznak a) antitrombin-111 [Thromb. Rés., 5, 439-- 452. /1974/J b) aj-proteáz inhibitor [Ann. Rev. Biochem., 52.655 — 709. ,c) aj-makroblobulin [Ann. Rev. Biochem., 52.655 — 709. /1983/J d) Cj-inhibitor [Biochemisstry, 20, 2738-- 2743. /1981/J e) Nexin proteáz [J. Biol. Chem., 258. 10439-- 10444. /1983/1. 2. Az alvadási faktort proteolízis révén elbontó és ezáltal az alvadási faktort inaktiváló proteinek. Csak egyetlen ilyen proteint írtak le eddig, ez a C protein [J. Bioi. Chem., 251, 355-363. /1976/J. 3. Azok a proteinek, amelyek a negatív töltésű foszfolipideket leárnyékolják és/vagy hidrolizálják és így a véralvadási mechanizmus foszfolipidfüggő reakcióit gátolják. Ezidáig csak foszfolipázokat írtak le, amelyeket különböző kígyóméregféleségekből izoláltak [Eur. J. Biochem., 112, 25- -32/1980/]. A véralvadás lépcsőzetesen végbemenő folyamatának rendszerét az utóbbi években behatóan tanulmányozták. Megállapítást nyert, hogy különböző egymással összefüggő proteolitikus reakciók fokozatos, többlépcsős rendszeréről van szó, amelyben egy enzim egy zimogénl aktív formává alakít [C. M. Jackson, Y. Nemerson, Ann. Rev. Biochem., 49, 765-811. /1980/|. A reakció sebességét foszfolipidek és más kofaktorok, ilyen az Va faktor és a VlIIa faktor, döntő módon fokozzák. A prokoagulációs reakciókat in vivo a különböző gátló mechanizmusok szabályozzák, amelyek az alvadási folyamat kismértékű aktiválása után megelőzik a robbanásszerű trombolikus traumát. Az anti-alvadási mechanizmusok a következőképpen csoportosíthatók [R.D. Rosenbert, J. S. Rosenbert, J. Clin. Invest., 74, 1 — 6. /1984/]: 1. A Xa szerin-proteáz faktor és a trombin az antitrombin-IU-hoz, illetve az antitrombin/heparin-komplexhez való kötődés révén inaktiválódik. Ilyen módon mind a protrombin aktiválás, mind a fibrin képződés gátolt lesz. Az antitrombin-IU-on kívül még különböző más plazma-proteáz inhibitorok is vannak, mint például az ajmakroglobulin és az antitripszin, amelyeknek a hatása időtől függő. 2. A C protein felfedezése egy további anti-alvadási mechanizmus megismeréséhez vezetett. Ha a C protein aktiválódott, akkor ez antikoagulánsként hat az Va és Vili, protein faktorok szelektív proteolízise révén, mivel ezek a proteinázt és az X faktorral reagáló enzimet inaktiválják. 3. A plazmin hasítja a monomer fibrin 1-et — ez a trombin fibrinogénre való hatásának terméke -, s így megakadályozza, hogy oldhatatlan fibrin képződjék [J. L. Nőssel, Nature, 291, 165-167. /1981/J. A fent említett, az alvadási folyamatra ható és a szervezetben előforduló proteinek közül jelenleg csak az antitrombin-III-nak van klinikai alkalmazása. Kitűnt azonban jelentős hátránya, mivel e protein alkalmazásakor a vérzékenységre való hajlam növekszik. Minden eddigi antikoagulánsként alkalmazott szer, akár szervezetben előforduló, akár szintetikus anyagról van szó, valamilyen módon hatástalanítja az alvadási faktorokat és ezáltal olyan mellékreakciókat okoz, amelyek hátrányosan befolyásolhatják az alvadási folyamatot. Jelen találmány feladata az volt, hogy egy olyan szert szolgáltasson, amely véralvadásgátló tulajdonságokkal rendelkezik, de az eddig ismert antikoagulánsoknak az alvadási folyamatra ható hátrányos tulajdonságai nélkül. Meglepő módon, olyan szervezetben előforduló proteineket tudtunk izolálni, amelyek véralvadásgátló tulajdonságokat mutattak, de nem növelték az elvérzés veszélyét. További meglepő tulajdonságuk az, hogy nagyobb vérzésekkor ezek a proteinek elvesztik gátló tulajdonságaikat, így a szokásos alvadási folyamatok zavartalanul lefolyhatnak és az elvérzés veszélye nem áll fenn. Jelen találmány tárgya, a következőkben VAC-nak (Vascular Anti-Coagulant) nevezett olyan véralvadásgátló proteinek előállítása, amelyek az alvadási faktorokat nem inaktiválják. Ezek a proteinek képesek arra, hogy egy vaszkuláris prokoaguláns, azaz az Xa faktor által indukált alvadást meggátolják, de a trombin által indukált alvadást nem. Nem gátolják a Xa és IIg faktorok biológiai és amidolitikus aktivitását sem. A találmány tárgya tehát olyan véralvadásgátló proteinek előállítása, amelyek az alvadási faktorokat nem inaktiválják és gátolják:- a módosított protrombin-időt és/vagy- a módosított, aktivált parciális tromboplasztin-időt és/vagy- a nem módosított protrombin-időt és/vagy- negatív töltési foszfolipidek és Ca2 + ionok jelenlétében az Xa alvadási faktor hatására bekövetkező protrombin aktiválódást és/vagy- negatív töltésű foszfolipidek és Ca2+ ionok jelenlétében a IXa faktor hatására végbemenő intrinsic X faktor aktiválódást és/vagy- az izolált, stimulált trombociták által történő protrombin aktiválódást és/vagy- az érfal által indukált alvadást és/vagy az aivadásfüggő trombocita aggregációt. A találmány tárgyát képező véralvadásgátló proteinek az alvadási faktorokat nem inaktiválják és amelyeknek a gátló hatása a foszfolipidek mennyiségétől függ. A találmány szerinti proteinek idézik elő a Xa faktor által létrejövő protrombin aktiválódás gátlását. A gátlás a foszfolipid koncentrációtól függ és nagy foszfolipid kon5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
