199882. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, vazopresszin antagonista hatású, polipeptidek és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 199882 B 2 A kapcsolási lépések végrehajtása után az A) lépésben kapott peptid-gyanta terméket 1 órán át ecetsavanhidriddel reagáltatjuk, hogy a reagálatlan aminocsoportokat acetilezzük. B) Boc-(Ó-etil)-D-tirozil)-fenilalanil-valil- 5 -aszparagil-(QBzl)-6.6-ciklopentametilén-2- -D.L-amino-szuberinsav-prolil-(N-Tos)-arginil-BHA-gyanta előállítása Az A) lépés szerinti, három egységet tartalmazó gyantát további 4 ciklusban Boc-Asn-nal, 10 Aminosav Boc-Val-nal, Boc-Phe-nal és Boc-D-Tyr(OEt)nal kapcsoljuk manuális peptid szintetizátorban DCC/HBT kapcsoló reagens és diklór-metán-DMP oldószerelegy alkalmazásával. Minden egyes kapcsolást kvalitatív ninhidrin-próbával ellenőrzünk, ha a próba pozitív, a kapcsolás nem teljes, ilyenkor a kapcsolási reakciót tovább folytatjuk. Az alkalmazott reagensek mennyisége a következő: DCC HBt Boc-Asn 560 mg 496 mg Boc-Val 521 mg 8 ml/0,3 mmól/1 oldat Boc-Phe 636 mg 496 mg Boc-D-Tyr (Et) 672 mg 4% mg 621 mg 621 mg 621 mg 621 mg Ezután a peptid-gyanta terméket vákuumban megszárítjuk. így a cím szerinti köztiterméket nyeljük. C) H,N-D-Tyr (EO-Phe-Val-Asn-D.L-Pas-Pro-ArgNH? előállítása 25 A B) lépés szerint kapott peptid-gyanta terméket 20 ml vízmentes hidrogén-fluoriddal reagáltatjuk 0 “C-on, 1,5 ml anizol megkötőanyag jelenlétében 1 órán át, a reagáltatás során a peptid lehasad a hordozógyantáról és egyidejűleg lezaj- 30 lik az amino- és karboxilcsoportok védőcsoportjainak lehasadása is. Ezután a HF-t 0 °C-on vákuumban kidesztil látjuk a reakcióelegyből. A visszamaradó anyagot éterrel eldörzsöljük, az étert elöntjük, a szilárd 35 anyagot 3x10 ml dimetil-formamiddal és 3x10 m| 30%-os vizes ecetsavval gondosan extraháljuk. Az extraktumokat egyesítjük és vákuumban olajjá pároljuk be. Az olajat 5%-os vizes ecetsavban vesszük fel, majd liofUizáljuk. így 195 mg fehér 40 port nyerünk. A kapott nyers lineáris peptid, az H2N-D-Tyr (Et)-Phe-Val-Asn-D,L-Pas-Pro-ArgNH2-acetátsó két nagyobb komponens elegyének bizonyult mind nagynyomású folyadékkromatográfiás vizs- 45 gálát (Ultrasphere ODS® oszlop, 0,1% trifluorecetsav (TFA) tartalmú 50%-os vizes acetonitril iluens), mind vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat (szilícium-dioxidon, n-BuOH — etil-acetát—ecetsav—víz 1:1:1:1 arányú elegyét alkal- 50 mazva futtatószerként) alapján, és a két fő komponens mellett ir^s komponenseket nyomokban tartalmaz. Ezt a nyers pepiidet ellenáramú megoszlásos eljárással tisztítjuk butanol-ecetsav—víz 4:1:5 55 arányú elegyének alkalmazásával 240 átvitellel. A frakciókat vékonyrétegkromatográfiás eljárással ellenőrizzük, és a megfelelő frakciókat összegyűjtjük, vákuumban bepároljuk, 1%-os vizes ccetsavoldatban felvesszük, majd liofilizáljuk. 60 I. frakció 28,5 mg II. frakció 110,0 mg III. frakció 35,0 mg Izokratikus nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálattal (Ultrasphere ODS®; 0,1% TFA tartalmú 40%-os vizes acetonitril, 1,5 ml/pcrc áramlási sebesség) egy 5,09 perc és egy 7,80 perc retenciós idejű csúcsot nyertünk. Az I, frakció főként az 5,09 perc retenciós idejű izomert tartalmazza (90%), a II. frakció a két izomert egyforma mennyiségben tartalmazza, míg a III. frakció főként a 7,80 perc retenciós idejű izomert tartalmazza. A FAB-MS spektrum eredményei igazolják a kívánt peptid jelenlétét mindhárom frakcióban (MH + = 1061, MH = 1059). Az eredmények azt mutatják, hogy a két csúcs a C) lépés cím szerinti lineáris peptid köztitermékének D- és L-izomerje. 1. példa D-Tyr (EtVPhe-Val-Asn-Pasié-Pro-ArgNH, előállítása A 2. referencia C) lépése szerint kapott 50 mg lineáris pepiidet jégecetben 1 n hidrogén-kloriddal reagáltatjuk, majd a reakcióelegyet vákuumban szárazra pároljuk. Ezt háromszor megismételjük. A visszamaradó anyagot száraz dimetilformamidban felvesszük, majd vákuumban bepároljuk. Ezt a műveletet háromszor megismételjük. (Ezáltal az aminosav ecetsavsóját és a guanidinocsoportokat in situ az erősebb, hidrogénklorid-sóvá alakítjuk, így az ecetsav felszabadításával kiküszöböljük a D-Tyr a-amino-csoportjának acetilezését jelentő mellékreakciót. Ezt az átalakítást némi anyagveszteség mellett ioncserélő oszlopon végzett kromatografálással is elvégezhetjük.) A visszamaradt anyagot a fenti kezelés után 7,5 ml száraz dimetil-formamidban oldjuk, majd 7
