199882. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, vazopresszin antagonista hatású, polipeptidek és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 199882 B 2 keverés közben 12,5 /il trietil-amint adunk hozzá, végül 20 fÁ difenil-foszforil-azidot (DPPA) adagolunk. A kapott elegyet szobahőmérsékleten, argongáz atmoszférában éjszakán át keverjük. A gyűrűzárás teljessé válását izokratikus nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással vagy fékonyrétegkromatográfiás eljárással ellenőrizzük. A reakcióelegyet ezután szárazra pároljuk, majd a maradékot 30%-os ecetsavban újra oldjuk. A sót G-15 Sephadex® gél oszlopon végzett gélszűréssel távolltjuk el. A terméket preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással Cjg oszlopon, 0,1% TFA tartalmú 45%-os vizes acetonitril mozgó fázis alkalmazásával tovább tisztítjuk és a D- és L-izomerekre választjuk szét. így 8,5 mg C és 5 mg D vegyületet nyerünk. A C és D vegyületek hidrolizátum-származékait autentikus L-Pas mintával királis gázkromatográfiás elemzéssel összehasonlítva azt találtuk, hogy a C vegyület L-Pas-t, a D vegyület D-Pas-t tartalmaz. C vegyület: FAB-MS spektrum (M + H)+= 1043, (M— H)-= 1041. HPLC: egyetlen csúcs retenciós idő: 9,72 perc. Aminosav analízis: Asp 1,00 Tyr 0,97 Pro 0,69 Phe 0,98 Val 0,95 Arg 1,10 D vegyület: FAB-MS spektrum (M + H) + = 1043, (M— H)"= 1041. HPLC: egyetlen csúcs, retenciós idő: 16,24 perc. Aminosav analízis; Psp 1,00 Tyr 0,92 Pro 0,76 Phe 0,97 Val 0,77 Arg 1,22 2. példa D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Pas-Pro-Arg-NH? előállítása Lineáris, védett Boc-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Pas(OBzl)-Pro-Arg(Tos)-BHyA-t állítunk elő a 2. referenciapéldában ismertetett módon, azzal az eltéréssel, hogy optikailag tiszta Boc-L-Pas(OBzl)-t alkalmazunk Boc-D.L-Pas(OBzl) helyett. A pepiidet a gyantáról úgy távolítjuk el, hogy a pepiid védőcsoportjait 10 ml folyékony hidrogén-fluoriddal 1 ml anizol jelenlétében 0 *C hőmérsékleten 50 perces reagáltatással lehasítjuk. A hidrogén-fluoridot vákuumban eltávolítjuk, a gyantát éterrel mossuk, majd levegőn szárítjuk. Ezután a gyantát 120 ml 10%-os vizes ecctsawal 120 ml 1%-os vizes ecetsavval, majd 120 ml vízzel mossuk. A vizes extraktumokat egyesítjük, vízzel hígítjuk, majd liofilizáljuk. így 213 mg nyers lineáris pepiidet nyerünk. 100 mg nyers lineáris peptidet G-15 gélen, 1%-os vizes ecetsav alkalmazásával gélszűréssel tisztítunk, így 62 mg tisztított lineáris peptidet nyerünk. 62 mg (58,4 /tmól) tisztított lineáris peptidet 5 ml ecetsavban oldunk, majd szárazra pároljuk. A visszamaradó anyagot DMF-ban oldjuk, majd szárazra pároljuk. Ezt a műveletet összesen háromszor ismételjük. Ezután a visszamaradó anyagot 10 ml DMF-ban oldjuk és 12,8 pl (1,1 mólekvivalens) difenil-foszforil-azidot, 17,8 pl (2,2 mólekvivalens) trietil-amint adunk hozzá. A reakcióelegyet 3 napig 4 °C-on tartjuk. Az elegyhez ezután további 6,4 pl difenil-foszforil-azidot és 8,9 pl (1,0 ekvivalens) trietil-amint adunk, majd éjszakán át 4 °C-on tartjuk. A reakcióelegyet ezután szárazra pároljuk, a kapott üveges anyagot éterrel eldörzsöljük, a nyers gyűrűs peptidet kiszűrjük és levegőn szárítjuk. A kapott 75 mg nyers gyűrűs peptidet preparatív nagynyomású oszlopkromatográfiás eljárással (HPLC) tisztítjuk (Hamilton PRP-1, 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó 1,45%-os vizes acetonitril eluens). A megfelelő frakciókat összegyűjtjük, szárazra pároljuk, majd 1%-os vizes ecetsavból liofilizáljuk. így 35,3 mg tisztított gyűrűs peptidet nyerünk. FAB-MS m/z 1043,7 (MH + ), HPLC k’= 2,92 (0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó 45%-os vizes acetonitrillel). A vegyület a 3. példa szerinti C vegyülettel együtt eluálódik. (k’ jelentése itt és a leírás további részeiben: egy az elválasztott vegyületre jellemző konstans, amely konstans egy adott tölteten, adott eluens alkalmazásakor csak az elválasztott anyagtól függ, az oszlop méretétől és az áramlási sebességtől független, reprodukálható paraméter. A nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárásban hasonló jellemzőként tekinthető, mint a vékonyrétegkromatográfiában az Rf érték. k’= Rt- Rto/Rto, ahol Rto a nem adszorbeálódott standard, Rt pedig a tiszta retenciós ideje). 3. példa Terminális kapcsolási eljárás A) D-Tyr(Et)-Phe Val-Asn-Pas-OCH? előállítása A védett peptid-gyanta köztiterméket, azaz a Boc-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Pas-OCH2-C6H4- -gyanta-OCH3-t manuálisan szintetizáljuk rázóberendezésen. Pas-OCHj-céziumsóból és klór-metil-gyantából vagy hidroxi-metil gyantával való közvetlen kapcsolással, DMAP/DCC kapcsoló reagenssel DMF-ban, 0,35 mekv./g helyettesítési mértékkel Boc-Pas(OCH2C6H4-gyanta)-OCH3-t állítunk elő. A védett peptid-gyanta köztiterméket lépésenként szintetizáljuk a Boc-védőcsoport 1:1 arányú TFA-CH2CI2 eleggyel való eltávolításával, majd DCC/HBT aktiváló és katalizáló reagensek alkalmazásával 1,0 mmól mennyiségben a megfelelő Boc-aminosavakkal végrehajtott egymást követő kapcsolásokkal, így a gyanta-peptid köztiterméket nyerjük. A cím szerinti peptidet a gyantáról való lehasítással nyeljük, a lehasítást 30 ml hidrogén-fluoriddal 3,0 ml anizol jelenlétében 0 °C-on 60 percig való reagáltatással vé-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
