199881. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vazopresszin antagonista hatású új bázikus peptidek előállítására
1 HU 199881 B 2 majd bepároljuk. A terméket végül preparatfv nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (S pl Ultrasphere ODS) tisztítjuk. íly módon 17%-os hozammal 5 mg tiszta [l-(//?-Merkapto-0,/?-ciklopentametilén/-propionsav)-2-D-tirozin-4-valin-8-(l,5-diamino-pentán)-8-dezarginin-9-dezgIicinamid]-vazopresszint nyerünk. A termék szerkezetét FAB-MS eljárással [(M + H)+ * 980] és aminosavanalízissel (Asp = 1,00; Pro = 1,37; Cys = 0,37; Val= 0,83; Tyr= 0,83; Phe= 0,86) igazoltuk. A termék tisztaságát nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással ellenőriztük (5 p Ultrasphere ODS; 4,6x250 mm; 70:30 arányú 0,5 mól/l-es vizes KH2PO4/CH3CN elegy; 1,5 ml/perc áramlási sebesség; K’ ■= 13,7 perc), a termék tisztának bizonyult. 3. példa A (III) általános képletű vegyület előállítása A 2. példa szerinti eljárással putreszcinből előállított 1,25 g (6,6 mmól) mono-Boc-l,4-diamino-butánt 2 ml dioxánban és 6,5 ml vízben 1,25 g (7,26 mmól) O-metil-izokarbamid-hidrogén-szulfáttal és 3,75 ml 2 n vizes nátrium-hidroxid-oldattal reagáltatunk. A kapott oldatot 6 napon át keverjük, majd az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a visszamaradó anyagot 2 n nátrium-hidroxiddal pH = 12-re lúgosítjuk. Az anyagot ismét bepároljuk, a maradékot etil-acetátban felvesszük, szűrjük, majd mégegyszer bepároljuk. A kapott nyers guanidin-vegyületet a toluol bepárlásával szárítjuk és további tisztítás nélkül használjuk fel. 410 mg (1,78 mmól) nyers guanidin-vegyületet 2 ml 2n vizes nátrium-hidroxidban és 2 ml vízben oldunk, majd szobahőmérsékleten 340 mg (1,78 mmól) p-toluolszulfonil-kloriddal 18 órán át reagáltatjuk. Ezután a pH-t 5%-os nátrium-karbonát oldattal 8-ra állítjuk, az elegyet etil-acetáttal extraháljuk, majd bepároljuk. így 437 mg nyersterméket kapunk. Ezt oszlopkromatográfiásan tisztítva (3x15 cm-es oszlop, szilícium-dioxid töltet, eluens: 80% etil-acetát/hexán elegy) 39%-os hozammal 265 mg kívánt tozilezett terméket nyerünk. A kapott terméket *H-NMR és Ci-MS eljárásokkal azonosítjuk. 108 mg (0,281 mmól) tozil-guanidino-diamint 1 ml metilén-kloridban oldunk és 0 °C hőmérsékleten 40 percig reagáltatjuk 1 ml trifluorecetsawal. A reakcióelegyet ezután bepároljuk, a visszamaradó anyag pH-ját 5%-os nátriumkarbonát oldattal 8-ra állítjuk, majd az anyagot szárazra pároljuk. A visszamaradt anyagot etilacetátban felvesszük, szűrjük, majd bepároljuk. A kapott nyers dez-Boc terméket a toluol lepárlásával szárítjuk. íly módon 82%-os hozammal 66 mg terméket nyerünk, amelyet XH-NMR vizsgálattal azonosítunk, majd további tisztítás nélkül használjuk fel. 35 mg (0,028 mmól), az 1. példa szerint előállított [ l-(//9-merkapto-/7,0-ciklopentametilén/-propionsav)-2-D-tirozin-4-valin-8-(l,5-diamino-pentán)-8-dezarginin-9-dezglicinamid]-vazopresszint 0,5 ml dimetil-formamidban oldunk és szobahőmérsékleten 33 mg (0,114 mmól) tozil-guanidino-aminnal, 12 mg (0,057 mmól) DCC- del és 8 mg (0,057 mmól) HBT-lal reagáltatjuk. Az elegyet 43 órán át keverjük, majd az oldószert vákuumban eltávolítjuk és a visszamaradó anyagot 2 ml trifluor-ecetsavban oldjuk. Az oldatot szobahőmérsékleten keverés mellett 2 órán át reagáltatjuk 150 pl (1,7 mmól) trifluor-metánszulfonsawal és 37 pl anizollal. A reakcióelegyet ezután szárazra pároljuk, a maradékot 10%-os ecetsav-oldatban oldjuk, az oldatot szüljük, majd BioRexR-70 oszlopon engedjük át. A nyers guanidin-vegyületet ezután piridin pufferrel (piridin/víz/ecetsav 30:66:4 arányú elegye) eluáljuk az oszlopról, az eluátumot bepároljuk, majd a viszszamaradó anyagot preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (5 p, ODS, CH3CN/H2O/TFA 40:60, 0,25%) tisztítjuk. íly módon 85%-os hozammal 6,9 mg tiszta (1 -{jß-merkapto-/?,/J-ciklopentametilén/-propionsav)-2-D-(Ó-etil)-tirozin-4-valin-8-(l-amino-4-guanidino-4-bután)-8-dezarginin-9-dezglicinamid]-vazopresszint nyerünk. A kapott nyerstermék felét preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással tisztítjuk. Eluensként 0,05 mól/l-es vizes KH2PO4/CH3CN 60:40 arányú elegyét alkalmazzuk. íly módon 1 mg terméket nyerünk, amely nagynyomású folyadékkromatográfiás és vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal homogénnek bizonyult. A termék szerkezetét FAB-MS [(M + H)+ = 1036, (M-H)' = 1034] vizsgálattal azonosítottuk. A nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat paraméterei: eluens 0,05 mól/1 KH2PO4/CH3CN 60:40 elegye, IBM p C —18, 4,6x250 mm, áramlási sebesség 1,5 ml/perc K’ = 14,2 perc. A kapott termék n-butanol:ecetsav:víz 4:1:1 futtatóelegyben való vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatánál Rf= 0,57. 4. példa 40 mg (0,043 mmól), az 1. példa szerint előállított Pmp-0-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-OH(D-Tyr(Et)2-prolin) és 26 mg (0,129 mmól) Boc-l,5-diamino-pentán 900 pl dimetil-formamidban készült oldatát 13 mg (0,065 mmól) DCC-del és 9 mg (0,065 mmól) HBT-lal reagáltatjuk keverés mellett szobahőmérsékleten 43 órán át. Ezután a dimetil-formamidot vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot 0 cC-on 1 órán át trifluor-ecetsawal reagáltatjuk. Ez idő elteltével a trifluor-ecetsavat vákuumban eltávolítjuk, és a visszamaradó anyagot 1%-os ecetsavban felvéve BioRexR—70 (H*) ioncserélő oszlopon engedjük át. A bázikus terméket piridinpufferrel (víz/piridin/ecetsav 66:30:4) eluáljuk az oszlopról, majd az eluátumot bepároljuk. Utolsó tisztítási lépésként preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárást (5 p Ultrasphere ODS) alkalmazunk. Ily módon 30%-os hozammal 13 mg tiszta B [l-(//?-merkapto-/?,/?-ciklopentametilén/-propionsav)-2-(0- -etil-D-tirozin)-4-valin-8-(l,5-diamino-pentán)-8-dezarginin-9-dezglicinamid]-vazopresszint nyerünk. A termék szerkezetét FAB-MS eljárás-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
