199881. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vazopresszin antagonista hatású új bázikus peptidek előállítására
1 HU 199881 B 2 •al igazoltuk [(M + H)+ « 1008], tisztaságát nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (5 p Ultrasphere ODS, 4,6x250 nun, eiuens: viz/CH3CN 60:40, 0,25% TFA tartalommal, K*-17,9 perc.) 5. példa 10 ml (99,5 mmól) 1,4-diamino-bután 70 ml metilén-kloridban készült oldatát 7,24 g (33,2 mmól) di-(terc-butil)-dikarbonáttal reagáltatjuk 0 #C-on, majd a kapott reakcióelegyet szobahőmérsékleten 71 órán át keverjük. A reakcióelegyet 75 ml - loroformmal hígítjuk, 5%-os vizes nátrium-karbonát-oldattal mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, majd bepároljuk. A visszamaradó nyersterméket minimális mennyiségű (10 ml) 1 n hidrogén-kloridban oldjuk, majd éterrel kétszer mossuk. A vizes fázist 2 n vizes nátrium-hidroxiddal pH = 10-re lúgosítjuk, majd etil-acetáttal extraháljuk. Az extraktumot vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, majd bepároljuk. Ily módon 13%os hozammal 821 mg t-Boc-putreszcin-(l,4-diamino-bután)-t nyerünk, amelynek szerkezetét ^-NMR és CI-MS ((M + H)+ = 189] vizsgálattal azonosítottuk. 48,6 mg (0,0526 mmól) az 1. példa szerint előállított Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro- OH és 30 mg (0,158 mmól) mono-t-Boc-l,4-diamino-butánt 500 pl dimetil-formamidban oldunk, majd 16 mg (0,079 mmól) DCC-del és 11 mg (0,079 mmól) HBT-lal reagáltatjuk. Az elegyet szobahőmérsékleten 114 órán át keverjük, majd a dimetil-formamidot vákuumban eltávolítjuk, és a visszamaradó anyagot 1%-os ecetsavban felvéve BioRexR —70 (H)+ ioncserélő oszlopon engedjük át. Az oszlopról a bázikus terméket piridin pufferrel (víz/piridin/ecetsav 66:30:4) eluáljuk, majd az eluátumot bepároljuk. íly módon [l-(//?-merkapto-/3,/3-ciklopentametilén/-propionsav)-2-(0-etil)-D-tirozin-4valin-8-(l,4-diamino-bután)-8-dezarginin-9-dezglicinamid]-vazopresszint nyerünk. Ezt a terméket preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (5 p Ultrasphere ODS) tovább tisztítva 36% hozammal 19 mg tiszta terméket nyerünk. A kapott termék szerkezetét FAB - MS vizsgálattal [(M + H)+ = 994, (M - H)- = 992] és aminosavanalízissel (Asp = 1,00; Pro = 0,98; Cys = 0,73; Val = 0,94; Tyr = 0,86; Phe = 0,94) igazoltuk. A termék tisztaságát nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (5 p Ultrasphere ODS, 4,6x250 mm; 0,05 .nól/1 KH2P04/CH3CN 60:40; K’ - 11,2 perc; 0,05 mól/1 KH2P04/CH3CN 80:20 — 60:40 gradiens; K’ - 41,3 perc) ellenőriztük. 6. példa 88 mg (0,511 mmól) 0-metil-izokarbamid-hidrogén-szulfátot 3 ml vízben oldunk, és pH-t 3 n vizes nátrium-hidroxid-oldattal 10-re állítjuk. Ezután hozzáadjuk 8,3 mg (0,00835 mmól) az előzőek szerint előállított [l-(/0-mcrkapto-/?,0- ciklopentametilén/-propionsav)-2-(0-eti!)-tirozin-4-valin-8-dezarginin-9-dezglicinamid-8- •(l,4-diamino-bután)]-vazopresszin 2 ml vízben készül toldatát. Az elegy pH-ját 10-re állítjuk, majd a kapott oldatot 17 napon át hűtőszekrényben tároljuk. Ezután az oldat pH-ját 1%-os vizes ecetsavval 4,5-re állítjuk. Az oldatot ezután bepároljuk, a maradékot 1:1 arányú víz/CH3CN elegyben felvesszük, majd preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (5 p ODS) tisztítjuk. íly módon 64%-os hozammal 5,5 mg [ 1-(/ß-merkapto-/3,/3-ciklopentametilén/-propionsav)-2-(0-etil-D-tirozin)-4-valin-8-(l-amino-4-guanidino-bután)-8-dezarginin-9-dezglicinamid]-vazopresszint nyerünk. A kapott termék szerkezetét FAB-MS eljárással ](M + H) + = 1036] azonosítjuk. A termék tisztaságát nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (5 p ODS; IBM; 4,6x250 mm; 0,05 mól/1 KH2P04/CH3CN 60:40; K’= 17,2 perc; 0,05 mól/1 KH2P04/CH3CN 80:20-50:50 gradiens; K’ = 32,3 perc) ellenőrizzük. A kapott termék Rf értéke a 3. példánál megjelölt vékonyrétegkromatográfiás rendszerben Rf = 0,57. 7. példa PMP-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(OH) szintézise A cím szerinti vegyületet az 1. példa szerinti szilárd fázisú eljárással állítjuk elő, de kiindulási anyagként Boc-Cys-Merrifield gyantát alkalmazunk, amelyet egymás után a megfelelő Boc-aminosavakkal kapcsolunk össze, majd a védőcsoportot hidrogén-fluoriddal eltávolítjuk, lehasítjuk a gyantáról, majd az előzőekben leírt módon oxidációs gyűrűzárást hajtunk végre. A tisztítást Cia (gyors) oszlopkromatográfiás eljárással (flash kromatográfia) és preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással végezzük. Hozam: 65 mg 0,5 mmól M = 827 kiindulási anyagból 65/827x100 = 16%. Aminosavanalízis: 85% aminosav N tartalom alapján: Asp = 1; Cys = 0,47; Val = 0,96; Tyr — 0,98; Phe = 0,94. FAB MS: (M + H) + = 827, (M - H)' = 825. Nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat: 5 p Cjg oszlop és 0,1% TFA tartalmú víz/CH3CN 60:40 eluens alkalmazásával egy csúcsot kapunk, ami a kapott termék tisztaságát mutatja. 8. példa 32,6 mg (0,0394 mmól), a 7. példa szerint előállított Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-OH és 24 mg (0,118 mmól) mono-terc-Boc-l,5-diamino-pentán 1 ml dimetil-formamidban készült oldatát 12 mg (0,059 mmól) DCC-del és 8 mg (0,059 mmól) HBT-lal reagáltatjuk. Az elegyet szobahőmérsékleten 90 órán át keverjük, majd a dimetil-formamidot vákuumban eltávolítjuk belőle. A visszamaradó anyagot 5 ml trifluor-ecetsawal reagáltatjuk 0 °C hőmérsékleten 3 órán át. Ezután a trifluor-ecetsavat vákuumban eltávolítjuk, a visszamaradó anyagot 10%-os ecetsavban felvesszük, majd BioRexR—70 (H)+ ioncserélő oszlopon engedjük át. A bázikus terméket piridinpufferrel (víz/piridin/ecetsav 66:30:4) eluál-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
