199881. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vazopresszin antagonista hatású új bázikus peptidek előállítására
1 HU 199881B 2 1. példa Eljárás a (II) általános képletű gyűrűs sav köztitermék előállítására Boc-Pro-Merrifield gyantát készítünk 233 mg (1 mmól) Boc-Pro és Merrifíeld gyanta összekapcsolásával a céziumsó-eljárás alkalmazásával, ily módon Boc-Pro-OC^C^Hj-gyanta terméket kapunk, amelyet a szintézis kiindulási vegyületeként alkalmazunk. A szintézist Beckman 990B peptidszintetizátorban végezzük a következő módon: 3 mólekvivalensnyi aminosavat a neki megfelelő oldószerben oldunk — a 4-Me-Bzl- Cys, a Val, Phe és 4-Me-Bzl-Pmp Boc származékait metilén-kloridban; az Asn-t dimetil-formamidban; az X-t, amely például D-Tyr(Et) vagy BrZ-D-Tyr, 1:1 arányú metilén-klorid/dimetil-formamid elegyben — és az összekapcsolást ekvimoláris mennyiségű diciklohexil-karbodiimid (DCC) és 1-hidroxi-benzotriazol (HBT) alkalmazásával végezzük, kivéve a 4-Me-Bzl-Pmp-vel való kapcsolást, ahol 1,0 mólekvivalens dimetil-amino-piridint alkalmazunk katalizátorként. Az összekapcsolódás mértékét aliquot mintából kvalitatív ninhidrid reakcióval határozzuk meg, és szükség esetén az összekapcsolási reakciót megismételjük. A Boc csoportot 1:1 arányú trifluor-ecetsav/metilénklorid eleggyel távoli tjük el, majd mosás után a szabad aminosavat 5%-os diizopropil-etil-amin/metilénklorid elegy alkalmazásával nyeljük. A 4-Me- Bzl-Pmp kapcsolása előtt ellenőrizzük a peptid aminosav sorrendjét — szilárd fázisú szekvencia vizsgálattal — és megbizonyosodunk homogenitásáról. Az utolsó kapcsolat létesítést követően a pepiidet megszárítjuk. így a Pmp-DTyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-gyanta vegyüíst előállítása esetén 2,24 g peptid-gyanta terméket nyerünk. 1,1 g (0,5 mól) Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-gyanta peptid-gyantát 3 ml anizollal jégfürdőben, 0 °C hőmérsékleten 60 percen át 25 ml vízmentes folyékony hidrogén-fluoridban (HF) keverünk. Ezután a hidrogén-fluoridot °C hőmérsékleten vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot négyszer 20 ml etil-éterrel mossuk» az etil-étert elöntjük, majd a peptidet háromszor 10 ml dimetil-formamiddal, háromszor 10 ml 20%-os ecetsavval és 3x10 ml 0,3 n ammónium-hidroxiddal eluáljuk. A szűrlethez 2 liter gáztalanított vizet adunk és pH-ját tömény ammónium-hidroxiddal 7,1-re állítjuk be. Ezután keverés közben 41 ml 0,01 mól/l-es kálium-ferricianid oldatot csepegtetünk hozzá, míg a halványsárga szín állandóvá válik. A kapott oldatot ezután 5x15 cm-es, C-18 szilán bevonatú szilikagéllel töltött oszlopra viszszük. Az oszlopot ezután 350 ml vízzel mossuk, és a peptidet 500 ml 0,25% trifluor-ecetsav tartalmú 1:1 arányú acetonitril/víz eleggyel eluáljuk. Az eluátumból 20 ml-es frakciókat szedünk. A 11 -17. frakciókat egyesítjük és besűrítjük. A visszamaradó anyagot tömény ecetsavban oldjuk, vízzel hígítjuk, majd liofilizáljuk. Ily módon 189 mg PmP-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-OH peptidet nyerünk, amelyet további tisztítás nélkül használunk fel a diaminnal való regáltatásra. A Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro(OH) azonosítása: Aminosavanalízis: Peptidtartalom 55%. Asp, 1,00, Pro, 1,23; Cys, 0,35; Val, 1,04; Tyr(Et), 1,43; Phe, 1,51. Nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint a termék tiszta. (Az eluens 40% CH3CN vízben, amely 0,25% trifluor-ecetsavat tartalmaz.) Pmp-D-Tyr-Phe-Val-Asn-Cys-Pro(OH) azonosítása Aminosavanalízis: Peptidtartalom 82%. Asp, 0,97; Pro, 1,10; Cys, 0,39; Val, 1,05; Tyr, 0,99; Phe, 0,99. Nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint a termék tiszta. (Eluens: 30% CH3CN/70% 0,05 mól/l-es KH2P04 elegy; 2 ml/perc, 5 n C-18, K’ = 6,14 perc). 2, példa 14,0 ml (120 mmól) 1,5-diamino-pentánt 70 ml terc-butanolban oldunk és 10 perc alatt hozzácsepegtetünk 9,2 ml (40 mmól) di-terc-butil-dikarbonátot. Az adagolás befejezése után a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 16,5 órán át keverjük. Ezután 90 ml 1 n vizes nátrium-hidroxid oldatot adunk hozzá, szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük, majd kloroformmal extraháljuk. A kloroformos extraktumot magnéziumszulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk, pH = 2- re savanyítjuk 3 n hidrogén-klorid-oldat 0 °C hőmérsékleten való hozzácsepegtetésével, majd a két védőcsoportot hordozó diamin eltávolítására éterrel mossuk. A vizes fázist 5%-os nátriumkarbonát oldattal meglúbosítjuk, majd etil-acetáttal extraháljuk. íly módon 20%-os hozammal 1,6 g mono-Boc-1,5-diamino-pentánt nyerünk. A szerkezetet *H-NMR és CI-MS vizsgálattal igazoltuk. 29,7 mg (0,0331 mmól) Pmp-D-Tyr-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-OH és 20,2 mg (0,0996 mmól) mono-Boc-l,5-diamino-pentán 400 pl dimetil-formamidban készült oldatához 10,3 mg (0,05 mmól) ciklohexil-karbodiimidet és 6,7 mg (0,05 mmól) 1-hidroxi-benzotriazol-hidrátot adunk. (A fenti peptidet az 1. példa szerinti eljárással, de D-Tyr(Et) helyett D-Tyr alkalmazásával állítjuk elő. 231 mg Boc-Pro kiindulási anyagból 2,20 g peptid-gyanta köztiterméket nyerünk, amelynek 1,1 g-jából kiindulva végezzük a gyűrűzárást. Tisztítás után 165 mg Pmp-D-Tyr-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-OH-t nyerünk.) A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 19 órán át keverjük, majd az elegyből a dimetil-formamidot vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot 0 °C hőmérsékleten 2 órán át trifluor-ecetsawal kezeljük. Ezután a trifluor-ecetsavat vákuumban eltávolítjuk, és a visszamaradó anyagot 1%-os ecetsavban Bio-Rex 70 (H + ) ioncserélő oszlopon engedjük át. A bázikus termékeket vlz/piridin/ecetsav 66:30:4 arányú elegyével lemossuk az oszlopról, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
