199878. lajstromszámú szabadalom • Eljárás acilezett splenopentinek és a vegyületeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199878 B 2 A találmány tárgya eljárás új splenopentin Arg-Lys-G 1 u-Val-Tyr pentapeptid-származékok előállítására és tisztítására. Ezeket a vegyületeket immunbiológiailag hatékony gyógyszerkészítményekben lehet használni. A splenopentint és származékait az orvosi terápiában immunregulátorként alkalmazzák. A találmány alkalmazási területe tehát a gyógyszeripar. Az elmúlt években számos kísérletet végeztek azon peptidek izolálására és jellemzésére, amelyek az immunrendszert befolyásolják. így izolálták a limopoietint és a splenint a timuszból, illetve a lépből (T. Audhya és munkatársai: Biochemistry 20, 6195/1981/). Annak ellenére, hogy különböző szervből származnak, ezeknek a peptideknek messzemenőleg hasonló a szerkezetük: 49 aminosavból állnak és mindössze a 34-es helyzetben tér el a szekvenciájuk; aszparaginsav, illetve glutaminsav található bennük. Biológiai aktivitásuk szempontjából azonban lényegesen eltérnek egymástól. A timopoietinek a neuromuszkuláris transzmissziót befolyásolják (M.P. Scheid és munkatársai: J. Exp. Med. 147, 1727 /1987/), a korábbi T-sejtek differenciálódását stimulálják, és a korábbi B-sejtek differenciálását gátolják. A splenin ezzel szemben a T- és a B-sejtek differenciálását stimulálja és nincsen neuroaktivitása. A splenin teljes molekula biológiai hatás minőségét a 32 — 36 rész-szekvenciája, Arg-Lys-Glu-Val-Tyr (splenopentin) reprodukálja. A biológiailag aktív anyagok előállítása egyre nagyobb mértékben magával vonja a nagyérzékenységű és gazdaságilag hatásos kromatográfiai tisztítási eljárásokat is. Elsősorban azok az eljárások jönnek szóba, amelyeknél egyszerű hordozó- és futtatószer-rendszer alkalmazása mellett nagy az anyagáthaladás, egyenletesen jó a reprodukálhatóság és nagy a rendszer rezolúció. A különböző acilezett splenopentin peptidek kromatográfiás elválasztásához, mivel a nagyszámú komponens esetében kicsik a töltés és ezáltal a polaritás különbségek, költséges és bonyolult kromatográfiás technikák alkalmazására van szükség. Előnyösen alkalmazhatók itt a HPLC- eijárások, RP (reverz fázisú) szilikagél alapon, valamint a normál szilikagél fázisokon végzett adszorpciós vagy megoszlásos kromatográfiás módszerek. A 3.421.614. számú német szövetségi köztársaság-beli (1984) szabadalmi leírásban splenopentinek kromatográfiás tisztítását szilikagél normál fázison, metil-klorid tartalmú futtatószerekkel javasolják. Javasolják ezenkívül a szintetikus splenopentin nyerstermékek kromatográfiás elválasztását adszorpciós, illetve megoszlásos kromatográfiával Kiesel-gél 60-on piridintartalmú szerves oldószerekkel. Hasonló elválasztási eljárást javasolnak a 2.804.566. számú német szövetségi köztársaságbeli 1X9111 szabadalmi leírásban timopentin, illetve monoacetil-timopentin tisztítására. Az RP- vagy normálfázisú szilikagélbázisú eljárások hátránya, hogy költséges készülékeket és anyagokat kell használni hozzá. így nagymennyiségű, nagytisztaságú termék előállítására ezek nem alkalmazhatók. További tényezők, amelyek ezek felhasználhatóságát korlátozzák: a rendszer kis kapacitása, a specifikus adszorpció miatti alacsony reprodukálhatósága, valamint a nem megfelelő rezolúciós képessége. A peptidek tisztítására alkalmazott szokásos ioncserélő kromatográfiás eljárások az eluálási folyamat alatt sókat alkalmaznak. így például a 2.732.587. számú német szövetségi köztársaságbeli és 3.617.646. számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírásban ismertetett kromatográfiás eljárások nona-, illetve dekapeptidek tisztítására icarboxi-metil-cellulózt és nátrium-kloridot, illetve ammónium-acetátot tartalmazó eluálószerekkel dolgoznak. Az anyagok tisztításához ezután mindig egy költséges sótalanítás is szükséges. A találmány feladata ezért eljárás kidolgozni új, immunológiailag hatékony splenopentin•származékok (SP5-származékok) előállítására és tisztítására. A találmány feladata továbbá immunbiológiailag hatásos gyógyszerkészítmények előállítása is. A feladatot az alábbiak szerint oldottuk meg. A találmány tárgya eljárás új, (I) általános képletű acilezett splenopentinek (Acil-SP5) előállítására — a képletben R1 jelentése hidrogénatom vagy 1 — 18 szénatomos alkanoilcsoport, R2 jelentése hidrogénatom vagy 1 — 18 szénatomos alkanoilcsoport, R4 jelentése hidroxilcsoport, aminocsoport vagy egy ORs általános képletű csoport, ahol R5 jelentése 1 — 4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy R1 és R2 közül legalább az egyik hidrogénatomtól eltérő. A találmány szerinti eljárást splenopentin•származékok előállítására úgy végezzük, hogy splenopentint, valamint részlegesen védett splenopentint egy ZR általános képletű acilezőszerrel, ahol Z jelentése reakcióképes csoport és R jelentése 1 — 18 szénatomos alkanoilcsoport, reagáltatunk, és így szelektíven acilezzük az arginint és/vagy a lizint N-helyzetben és/vagy a tirozint O-helyzetben. Azt tapasztaltuk, hogy mind a mono-, mind a diacil splenopentinek előállításához acilezőszerként előnyösen alkalmazhatók, az N-hidroxi-norborn-5-én-2,3-dikarboxamid-1 — 18 szénatomos karbonsavakkal alkotott észterei. A mono- és a diacetilezett splenopentineket előnyösen N-acetoxi-norborn-5-én-2,3-dikarboximid (acetil-ONB) vagy 1-acetoxi-benzotriazol (acetil-OBt) alkalmazásával állítjuk elő. A mono- és a diformil-splenopentinek előállítását előnyösen végezhetjük formil-ONB vagy formil OBt alkalmazásával. Azt tapasztaltuk, hogy az acetilezőszerként először alkalmazott acetil-ONB felhasználása különleges előnyökkel jár. Hidrolízissel szembeni nagy stabilitása miatt igen jó a tárolási stabilitása és acetilezésre mind szerves, mind vizes kö5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
