199873. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vankomicin típusú antibiotikumok kinyerésére
1 HU 199873 B 2 sztirol-divinil-benzol gyantának hívjuk. A gyanta mikropórusos, alacsony térhálósítási fokú (névlegesen 2%-os), erősen savas kationcserélő gyanta, mely rendszerint só, például nátriumsó alakjában van. Az eljárásban alkalmazható gyanta például a Dow XFS-43278.00 (Dos Chemical Industries, Ltd., Tokió, Japán). Felismertük, hogy ezek a gyanták felhasználhatók a vankomicin típusú glikopeptid antibiotikumok megkötésére anélkül, hogy fermentlevet előzőleg le kellene szűrni. A felhasznált gyanta mennyisége a fermentlé térfogatától és a termelődött antibiotikum menynyiségétől függően változik. Vagy a gyantát adjuk a teljes fermentléhez, vagy a teljes fermentlevet adjuk a gyantához, majd annyi ideig kevertetjük a gyantát a fermentlével, hogy az antibiotikum adszorbeálódjon a gyantán. Az antibiotikum adszorbeálódásához szükséges idő változó. Befolyásolja ezt például a fermentlé hőmérséklete. Előnyösen a fermentlevet 30 °C-ról 60 °C-ra emelve, csökken az ehhez szükséges idő, ugyanakkor csökken a viszkozitása, és ezáltal könnyebben kezelhető is. A szükséges idő általában maximum hat óra. Az antibiotikum megkötését követően a fermentációs közeget ismert eljárásokkal elválaszthatjuk a gyantától; például szűréssel, amikor szakaszosan keverjük a gyantát a fermentlével, vagy mechanikai elválasztással, amikor a fermentlevet ráfolyatjuk a gyantára. Az antibiotikumot ismert módon oldhatjuk le a gyantáról. Különösen előnyös eljárás, amikor 1) vízzel mossuk a gyantát; 2) a gyantát pH = 9—10 kémhatású vízben kevertetjük, amíg az antibiotikum le nem oldódik; 3) elválasztjuk a gyantát az antibiotikumot tartalmazó eluátum tói. Az eljárás 2) lépését előnyös pH= 10 — 11 kémhatásnál végezni. Az antibiotikumnak az eluátumból történő kinyerését és adott esetben a további tisztítását az ismert eljárások szerint végezhetjük. így például az oldott antibiotikumot tovább tisztíthatjuk oly módon, hogy a fentiek szerint nem-ioncserélő gyantán adszorbeáljuk. Egy másik eljárás szerint az antibiotikumot oldhatatlan rézkomplexként választjuk el. A rézkomplexet savas körülmények köpött hidrogén-szulfiddal reagáltatva az antibiotikum oldatba megy, és szabad bázisként elválasztható az oldat kémhatásának kellő értékre való beállításával. A szabad bázist készítményként dolgozhatjuk szájon át történő bevitelhez, vagy megfelelő savaddíciós sóvá, például hidrokloriddá vagy foszfáttá alakíthatjuk a szájon keresztüli vagy parenterális bevitelhez. Noha a találmány szerinti eljárás a vankomicin típusú antibiotikumok bármelyik tagjánál előnyösen alkalmazható, különösen alkalmas a fermentációval előállított vankomicin, M43A, M43B, M43C, M43D, A82846A, A82846B, risztocetin, A41030 A-G faktor, A47934, A35512 A-D faktorok, A355512 H faktor, aktaplanin A, Bj, Bj, B3, Cu, Cj, Ej, G és H faktorok, teikomicin Aj, teikomicin A} 1-5 faktorok és tei-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 komicin A3 antibiotikumok esretében. Az eljárás különösen alkalmas a vankomicin kinyerésére, minthogy kereskedelmi haszna miatt gyakran nagyon nagy mértékben állítják elő. Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető célzatúak és a találmány oltalmi körét nem korlátozzák. 1. (referencia) példa Az A82846 antibiotikum termeléséhez a fagyasztva szárított pelletként vagy folyékony nitrogén alatt tartott szuszpenzióként tárolt Nocardia orientalis NRRL 18099 mikroorganizmust ráoltjuk az alábbi összetételű táptalajra: alkotórész____________________mennyiség (%) 1,0 2,0 0,5 0,5 0,1 1 literre Chemical Co., glükóz oldható keményítő élesztőkivonat enzimmel hidrolizált kazein* kálcium-karbonát ionmentes vízzel feltöltve *NZ Amine A, Sheffield Norwichn NY, USA. Sterilizálás előtt a kémhatást pH = 7,5 értékre állítjuk be. A ferdeagar vagy lemez elkészítéséhez 2,5% agart adunk a tápközeghez. A beoltott ferdeagart 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 10-14 napon keresztül. A kinőtt tenyészetet steril eszközzel lekaparjuk. A spórákból és széttöredezett micéliumból álló anyag egynegyedével oltunk be egy 50 milliliter térfogatú első lépésű táptalajt. A beoltott táptalajt 250 milliliteres Erlenmeyer lombikban rázatjuk 5,08 cm kitérésű körkörös rázógépen percenként 250 fordulatszámmal, 30 °C hőmérsékleten 24 — 48 órán keresztül. Az így kapott első lépésű tenyészet 0,5 milliliterével oltjuk be a 250 ml-es széles szájú Erlenmeyer lombikban levő 50 ml termelő táptalajt, mely az alábbi összetételű: alkotórész____________________mennyiség (%) glükóz 2,50 szójaliszt 1,50 burgonyadextrin 3,00 kálcium-karbonát 0,25 melasz 0,30 savhidrolizált kazein* 0,5 ionmentes vízzel feltöltve 1 literre Sterilezés előtt a táptalaj kémhatását nátrium•hidroxiddal pH = 7,5 értékre állítjuk be. *Hy-Case, Sheffield Chemical Co. A beoltott táptalajt 30 #C hőmérsékleten rázatjuk 4-5 napon át percenként 250 fordulatszámnál egy 5,08 cm kitérésű körkörös rázógépen. Tankfermentációhoz nagyobb térfogatú oltóanyagra van szükség. 10 ml első lépésű tenyészetet használunk 400 ml második lépésű táptalaj beoltásához, melynek összetétele azonos az első lépésű táptalajéval. A második lépésű vegetatív tenyészetet egy kétliteres széles szájú Erlen-3
