199873. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vankomicin típusú antibiotikumok kinyerésére
1 HU 199873 B 2 meyer lombikban készítjük, 48 órán át 30 °C hómérsékleten rázatva egy 5,08 cm kitérésű körkörös rázógépen percenként 250 fordulatszám mellett. 1000 ml második lépésű vegetatív tenyészettel oltunk be 100 liter steril termelő táptalajt, melynek összetétele azonos az előzőekben ismertetett termelő táptalajéval, azzal a különbséggel, hogy literenként 0,3 g P-2000 habzásgátlót is adunk hozzá. A beoltott táptalajt egy 165 literes kevert tankfermentorban fermentáljuk 90—100 órán át 30 °C hőmérsékleten. A percenként 80 fordulatszámmal kevert tenyészet levegőztetését úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigén szintje a levegőtelítettség 50%-a felett legyen. A tcnkfermentálást elvégezhetjük úgy is, hogy megfelelő mennyiségű vegetatív tenyészettel egy 4536 literes (1600 gallon) tankfermentorban levő 3400 (1200 gallon) termelő táptalajt oltunk be. Az A82846 antibiotikum előállításához használhatunk Nocardia orientalis NRRL 18099 termelő törzset is. A fagyasztva szárított pelletként vagy folyékony nitrogén alatt tartott szuszpenzióként tárol törzset az előbbiek szerint tenyésztjük, azzal a különbséggel, hogy a termelő táptalaj ez esetben az alábbi: alkotórész_________________mennyiség (%) glükóz 1,0 burgonyadextrin 2,0 pepton (Bactopepton; Difco Láb.) 1,0 kálcium-karbonát 0,2 melasz 2,0 ionmentes vízzel feltöltve 1 literre pH beállítás nem szükséges. A82286 antibiotikumot Nocardia orientalis NRRL 18100 törzzsel is előállíthatunk. A fagyasztva szárított pelletként vagy a folyékony nitrogén alatt tartott szuszpenzióként tárolt törzszsel ugyan úgy járunk el, mint a Nocardia orientalis NRRL 18098 törzs esetében leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a savhidrolizált kazeinként Amicase készítményt (Sheffield Chemical Co.) használunk. A 4536 literes nagy térfogatú fermentálásokból származó 4200 liter tenyészlé kémhatását 5 n nátrium-hidroxiddal pH = 10,5 értékre állítjuk be, és a 3%-nak megfelelő mennyiségű Celite 545 szűrési segédanyagot adunk hozzá. A keveréket présszűrőn szűrjük, a kiszűrt anyagot vízzel mossuk. A szűrletet és a mosóvizet egyesítjük, a 4200 liter oldat kémhatását 5 n sósavval vagy kénsavval pH» 7 értékre állítjuk be, és NH+4 formában levő Dow XFS—43278 gyantaoszlopra visszük 200 liter szűrletre 10 liter gyantát számolva. Az oszlopot 750 ml/perc áramlási sebesség mellett eluáljuk. A frakciókat biológiai módszerrel — tesztorganizmusként Bacillus substilist használva — vagy HPLC-vel vizsgáljuk. Az oszlopot 5 oszloptérfogatnyi vízzel mossuk, 100 literes frakciókat gyűjtve. Az aktív anyagot 5 oszloptérfogatnyi 0,05 n ammónium-hidroxiddal oldjuk le a gyantáról 25 literes frakciókat gyűjtve. Az A82846 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldat térfogatát csökkentett nyomáson 30 liter körülire töményítjük. Ezt az oldatot vízágyban levő 10 liter Diaion HP — 20 gyantából készült oszlopra visszük. Az oszlopot 3 oszloptérfogatnyi vízzel mossuk 300 ml/perc áramlási sebesség mellett. A mosóvizet eldobjuk. Az aktív anyagot 1,0% ecetsavat tartalmazó víz/izopropilalkohol, 95:5 elegyével oldjuk le a gyantáról 100 ml/perc áramlási sebesség mellett. A 4 literes frakciókat biológiai módszerrel vagy HPLC-vel vizsgáljuk. Az A82846 antibiotikumot tartalmazó frakciókat (6—14. frakció) egyesítjük, csökkentett nyomáson betöményítjük és fagyasztva szárítjuk, 356 g nyers A82846 antibiotikumot nyerve. Az A82846 komponensek analitikai vizsgálatára kétféle HPLC rendszert használhatunk: A) Kationcserélő gyantaoszlop: oszloptöltet: Zorbax SCX (E. J. du Pont de Nemours et Co., Inc., Wilmington, Delaware 19898, USA); 4,6x150 mm oszlopméret; eluens: grádiens elució; 5 perc alatt A:B, 4:1 elegyből A:B, 1:9 elegybe áttérve, majd ezt tartva 15 percen át. A oldat» metanol/0,lM nátrium-dihidrogénfoszfát, 1:9; B oldat» metanol/0,9M nátrium-dihidrogénfoszfát, 1:9 áramlási sebesség: 1,0 ml/perc; detektálás: 225 nm. A retenciós idők függnek a koncentrációktól, de általában az alábbiak: A82846C = 6,6 perc A82846B = 8,9 perc A82846A = 9,5 perc. b) Fordított fázisú oszlopon: oszloptöltet: Zorbax ODS (EJ. du Pont de Nemours et Co., Inc., Wilmington, Delaware 19898, USA); 4,6x150 mm oszlopméret; eluens: grádiens elució; 1% ammónium-dihidrogén-foszfát/acetonitril 95:5 arányú elegyet elegyet 20 perc alatt 1:1 arányú elegyre változtatjuk; áramlási sebesség: 1,0 ml/perc; detektálás: 225 nm; retenciós idők: A82846A » 7,3 perc A82846C » 7,6 perc A82846B = 8,0 perc. Az alábbiakban ismertetjük az A82846 komponensek elválasztását és tisztítását. a) Az A82846A és az A82846B komponensek kinyeréséhez 30 g, a fentiekben ismertetett módon nyert nyers A82846 antibiotikumot 500 ml vízben oldunk, és egy 30 literes rozsdamentes acélhengerbe töltött LP — 1/Cjg szilikagél oszlopra visszük, melyet 1%-os ammónium-di hidrogén-foszfáttal egyensúlyoztunk ki. Az oszlopot gradiens elucióval eluáljuk 60 liter 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfáthoz 60 liter 1% ammónium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó víz/acetonitril, 88:12 elegyet vezetve. Az áramlási sebesség 250 — 300 ml/perc; maximális nyomás 600 psi. 4 literes frakciókat gyűjtünk, az eluálást 254 nm-en detektálva. Az egyes frakciókat analitikai 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
