199861. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tetradekanoilcsoporttal helyettesített 1-0-foszfono-D-glükopiranóz-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199861B 2 2. Endotrarin-sokk előidézése egérben A kísérlet abból áll, hogy endotoxin sokkot vagy más, halált okozó hasonló klinikai állapotot idézünk elő LPS-analóg anyagokkal (LPS» lipopoliszacharid), galaktózaminnal (GalN) szén* zibilizált egerekben. Csoportonként 6 darab, hím CS7 bl egérnek i.p. beadunk egyidejűleg 8 mg galaktózamint 0,5 nű foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) oldva és Salmonella abortus equi-ból (SIGMA) származó 0,1 Mg lipopoliszacharidot (LPS) 0,2 ml fiziológiás sóoldatban oldva. [C. Galanos és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei., USA 76, 5939 - 5943 (1979)]. A standard kezelésben az LPS helyett a kísérleti anyagokat adjuk be egyszer, különböző dózisokban, egyidejűleg a galaktózaminnal; vagy pedig parenterálisan vagy orálisan a galaktózaminnal végzett kezelés előtt vagy után. Az eredményeket úgy értékeljük ki, hogy összehasonlítjuk a legkisebb dózisokat, amelyek egy csoport valamennyi állatára halálosak; vagy az LDjQ-értékeket Spearman-Kárber módszerével számítjuk ki. 3. Mikróbás szeptikémia neutropéniás egerekben Ez a modell lehetővé teszi az immunválasz anyagfüggő növekedésének a meghatározását mikróbásan fertőzött neutropéniás egerekben. Neutropénia előidézésére 20 darab nőstény B6D2F1-egérből álló csoportoknak beadunk egyszer s.c. 200 mg/kg testtömeg ciklofoszfamidot 0,2 ml desztillált vízben feloldva a 0. napon. A harmadik napon a kísérleti anyagot beadjuk parenterálisan, elsősorban i.p. vagy orálisan, amennyiben lehetséges fiziológiás nátrium-klorid-oldatban oldva vagy más módon feloldva (0,3 ml). A fertőzés a 4. napon történik, a szóbanforgó inokulum i.v. beadásával 0,2 ml térfogatban (csíraszám például: Pseudomonas aeruginosa/ /egér A 12:1x10s; E.coli A 120:2xl06; Staph, aureus A 113:lxl06; Candida albicans A 124:1 x 104). A kísérleti állatokat a fertőzést követő 10. napig megfigyeljük, és elpusztulásukat naponta feljegyezzük. A kontroll vagy standard egerek fertzősével kapcsolatban a következő paramétereket számítjuk ki: a) átlagos túlélési idő, b) túlélési arány. Az (I) általános képletű vegyietekkel kezelt állatok jelentősen jobb túlélési időket és túlélési arányokat mutatnak, mint a kezeletlen kontrollok, Gram-negatív baktériumokkal (például Pseudomonas és E.coli) végzett kísérleti fertőzéseknél, valamint Gram-pozitív baktériumokkal (például Staph, aureus) vagy élesztőkkel (például Candida albicans) végzett fertőzéseknél parenterális beadás után. 4. Humán vér-neutrofil oxidációs metabolizmusának aktiválása Legalább 95% tisztaságú neutrofileket egy találmány szerinti vegyülettel három különböző koncentrációban 1-2 órán át 37 *C-on inkubálunk. ezután mérjük a sejtekből felszabaduló fzupcroxid-i ionokat, mint az aktiválás mértékét, a citokróm-C redukciójának szuperoxiddiszmutáz által történő gátlása formájában. 10*6 mól formil-metionil-leucil-fenilalanint tartalmazó 80 /jmól citokróm-C-hez lxlO6, a kísérleti vegyülettel előkezelt vagy kezeletlen neutrofilt adunk. A kontrollok még 50 Mg szuperoxid-diszmutázt is tartalmaznak. A reakciókeveréket 15 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd a kémcsövet jégfürdőbe helyezve, a reakciót leállítjuk. Ezután a kémcsöveket a sejtek elválasztása céljából 5 percig centrifugáljuk (400 g). A citokróm-C redukcióját, amely a felszabadult szuperoxid-anion mennyiségével arányos, 550 nm-en fotometriásan mérjük. A kísérleti vegyület inhibitorhatását az LPS-nak a PMN-re (PMN = polimorfonukleáris neutrofil leukocita) gyakorolt aktiválására a fenti módon mérjük, emellett a leukociták előinkubálása után a sejteket tovább inkubáljuk az LPS egy stimuláló koncentrációjával. 5. Szén klirensz teszt Ez a kísérlet azon az elven alapszik, hogy a 20,0 — 25,0 nm méretű részecskék (például szénszemcék) a szervezetből csak makrofágok által végzett fagocitózissal távolíthatók el. Szénszemcséket intravénásán beadva, ezeket a véráramból a makrofágok a májban (Kuppfer sejt) és a lépben fagocitózissal távolítják el. Egy anyag RES- aktivíválásának (RÉS = retikuloendoteliális rendszer) a meghatározását egyszeri vagy ismételt beadással, vizes oldatban vagy szuszpenzióban végezzük. Egy anyagnak a kezeléshez előre megállapított mennyiségét i.p. vagy s.c. adjuk be napi négy dózisban vagy egyszerre, 24 órával a kísérlet megkezdése előtt. 10% gázkorom tartalmú szuszpenziót 1%-os zselatinos nátrium-klorid-oldattal 16 mg szén/ml koncentrációra hígítunk. Mindegyik egér 0,2 ml/20 g testtömeg szuszpenziót kap i.v. Sz i.v. beadás után 3, 6, 9, 12 és 15 perccel az orbitális plexusból punkcióval 25 /ti vért veszünk. A vért 2 ml desztillált vízben hemolizáljuk. A széntartalmat fotometriásan meghatározzuk. Az állatokat ezután leöljük és a májuk és lépük súlyát megmérjük. 6. Herpeszfertőzés (egérben) Az intrakután herpeszfertőzés lehetővé teszi, hogy megállapítsuk a herpeszvírusokkal megfertőzött egereknél az immunválasz növekedésének fokát. A betegség lefolyása elhúzódó és lehetővé teszi, hogy megfigyeljük több paraméter egymást követő megjelenését. Herpesz léziók jelentkeznek a fertőzés helyén, amelyek elfekélyesednek, a közelebb lévő láb megbénul és a bénulás fokozódik, végül halált okozva. Immunkompetens "csupasz" (szőrtelen) egereket a 0. napon intrakután megfertőzünk, a kísérleti inokulumot 0,025 ml térfogatban (például a Herpes-simplex 1 típus lxl66 plakképző egységét/egér) beadva. A kísérleti vegyületet oldatban adjuk be i.p., például 0,1 ml fiziológiás sóoldatban. A szisztémás herpeszfertőzés tehát azt is lehetővé teszi, hogy meghatározzuk herpeszvírusokkal megfertőzött egereknél az immunválasz növekedésének fokát. Az immunkompetens NMRI egereket a 0. napon megfertőzünk, a kísérleti inokulumot 0,1 ml térfogatban i.p. beadva (például a Herpes-simplex 1 típus 1,3x10s plakképző egységét/egér). A 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
