199861. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tetradekanoilcsoporttal helyettesített 1-0-foszfono-D-glükopiranóz-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

1

HU 199861B

2

kísérleti vegyületet oldatban, például fiziológiás sóoldatban s.c. adjuk be.

A kísérleti állatokat a fertőzés utáni 20. napig megfigyeljük, és a léziók és bénulás megjelenését és a halál beálltát feljegyezzük. Mérjük az alábbi paramétereket, és ezeket a fertőzés kontrolljának vagy egy standardnak az adataival összehasonlítjuk:

a) az egerek száma, amelyeknél lézió lépett fel (kumulálódó);

b) az egerek száma, amelyeknél bénulás lépett fel (kumulálódó);

c) átlagos túlélési idő;

d) túlélési arány.

Az (I) általános képletű vegyületekkel kapott értékek a betegség lefolyását, a túlélési időt és a túlélési arányt tekintve, lényegesen jobbak, mint a kezeletlen kontrolioknál kapott értékek, a kísérleti Herpes-simplex vírus-1 fertőzés napját alapul véve a 0. vagy — 1. és a +6. napok között, egyetlen i.p., illetve s.c. dózis beadása után.

7. CSF (colony stimulating faktor) indukció A CSF-ok mediátorok, amelyek fertőzéseket vagy toxinhatásokat követően a szervezetben képződnek. Biológiai hatásuk komplex, ezt a vérképző rendszert, elsősorban a csontelősejtek szaporodásának a stimulálásával mutatjuk ki. B6D2F1 egereknek beadjuk a kísérleti vegyületeket, egyszer vagy ismételten, parenterálisan vagy orálisan, legfeljebb 50 mg/kg dózisban. Egymás után különböző időintervallumokban a kísérleti állatokból szérumot veszünk le. A szérum CSF-aktivitásának titerét sejttenyésztéses vizsgálattal, a B6D2F1 egerek csontvelősejt-szaporodásának a sebességével mérjük. [D. Metcalf: The Hemopoietic Colony Stimulating Factors, 1984, Elsevier; T. Mosmann; J. Immunol. Methods, 65, 55 —63 (1983); L. M. Green és munkatársai: J. Immunol. Methods, 70,257 - 268 (1984)].

Az (I) általános képletű vegyületek különböző mértékben indukálják egérben a CSF-okat, így a CSF-aktivitásokban mutatkozó idő-kinetikai különbségeket is megfigyeljük, s ez a terápiás alkalmazásnál hasznos lehet.

8. Interleukin-1 (IL -1) indukció

Annak meghatározását, hogy egy anyag stimulálja-e a sejteket TL— 1 termelésre, elsősorban sejttenyésztéses vizsgálattal végezzük. Először egerek adherens makrofágjait izoláljuk, mind a rezidens makrofágokat, mind a tioglikoláttal eltávolított makrofágokat. Ezeket a kísérleti vegyületeket különböző koncentrációival 48 órán át RPMI táptalajban inkubáljuk, és a sejt-felülúszókat elkülönítjük. Ezeket IL — 1 aktivitásra megvizsgáljuk C3H/HeJ egerek timocita tenyészeteiben. A makrofágok által termelt IL—1-et tartalmazó felülúszók timocitái 72 órás inkubálás alatt szaporodni kezdenek. A szaporodást 3H-timidin beépítésével mérjük, szcintillációs számlálóban [J. Gery és munkatársai: J. Exp. Med. 136, 128-142 (1972); J. Oppenheim és munkatársai: Cellular Immunoi. 50, 71—81 (1980)].

Az (1) általános képletű vegyületek különböző arányokban (0,1—50 jtg/ml koncentrációkban)

képesek indukálni IL-1 termelést makrofágokban.

9. LPS (endotoxin) tolerancia (halálozási tolerancia) indukció

‘ Az úgynevezett tolerancia indukálható egerekben, LPS-ot 1—3-szor naponta parenterálisan beadva. Ez a tolerancia megvédi az állatokat a galaktózamin beadását követően beadott LPS halálos hatásai ellen (endotoxin-sokk előidézését egerekben lásd fent).

Az (I) általános képletű vegyületek ezt a toleranciát már egyetlen, 0,25 mg/egér i.p. dózis beadása után előidézik. Előkezelt (toleráns) egerek LPS kiváltó dózist kapnak, 0,01 pg LPS + 8 1* mg galaktózamin/egér mennyiségben, i.p., különböző intervallumokban (1 nap—3 hét) az utolsó kezelést követően. Az állatok nagyobb hányada túléli az LPS kiváltó dózist, főképpen három alkalommal ismételt beadás után, mint az 20 előre nem kezelt, kiváltó dózist kapott kontrollok.

Az (I) általános képletű vegyületek gyulladásgátló hatásúak is, elsősorban nem-specifikus, immunológiásan indukált és magas vérnyomás által 2* előidézett gyulladásoknál és allergiás reakcióknál. Ez a hatásuk különböző kísérleti eljárásokkal bizonyítható, például vizsgálva hatásukat a prosztaglandin szintézisre in vitro és in vivo. In vitro vizsgáljuk az LPS- és zymosan-indukálta 30 PGE2- és PGFJa-felszabadulás gátlását. NMRI egerekből származó, tioglikoláttal stimulált peritoneális liukocitákat LPS-dal vagy egy kísérleti anyaggal 24 órán át inkubálunk. Táptalajt változtatva és a sejteket háromszor mosva, ezeket 2 35 órán át LPS-dal, illetve 1 órán át zymosannal stimuláljuk. Ezekben a felülúszókban a PGE2-t és a PGFFla-t meghatározzuk. Azt találjuk, hogy a LPS-dal, illetve a zymosannal stimulált sejtek a PGE2-termelést gátolják.

40 In vivo a kísérleti anyagokkal előkezelt egerek peritoneális leukocitáinak gátló hatását mérjük az LPS-indukálta PGE2-felszabadulásra. Három NMRI egérből álló csoportokat az 1., 2. és 3. napon LPS-dal, illetve a kísérleti anyaggal keze- 45 lünk i.p. A 4. napon ezek az állatok és a kontrollcsoport egerei i.p. 1,5 ml tioglikolátot kapnak, a 7. napon az egerek peritoneális leukocitáit elkülönítjük és LPS-dal stimuláljuk. A kontrolokkal összehasonlítva a PGE2-felszabadulás 50 jelentős csökkenése figyelhető meg.

Egy következő kísérletben mérjük a prokoaguláns aktivitásra (PCA) gyakorolt hatást. LPS- dal végzett stimulálás után a humán endoteliális «ejtek PCA-t szintetizálnak, amint ez a plazma 55 rövidebb alvadási idejéből megállapítható. Egerek peritoneális leukocitái LPS-kezelés után és uyulakból izolált peritoneális leukociták a generalizált Shwartzman-reakció kiváltása után rekalcifikált plazma alvadási idejét ugyancsak 60 megrövidíti. In vitro, az LPS által indukált PCA- ra gyakorolt hatás vizsgálatához tioglikoláttal Stimulált B6D2Ft egerek peritoneális leukocitái éjszakán át LPS-dal egyedül, illetve LPS-dal és a kísérleti anygagal kezeljük magzati botjúszérum- 65 tói (FCS) mentes DMEM táptatalajban (a/ kí-4