199775. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminosavak telítetlen zsírsavakkal képzett sóinak valamint ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 199775 B 2 A találmány szerinti eljárással előállított vegy ületek hatékonyságát, w-3 politelítetlen zsírsavelegy (EPA- tart. 27,6 %, DHA-tart. 44,6 %) 1-lizinnel alkotott sójának (tesztvegyület) a Hep 2 (humán epiteliális tumorsejtvonal) sejtek szaporodására, illetve morfológiájára gyakorolt hatása és a sejttenyészetre gyakorolt esetleges toxicitása alapján tanulmányoztuk. A kísérleteket 6x4 férőhelyes (1,9 cm2 alapterületű mélyedések) műanyag szövettenyésztő lemezen végeztük. A tesztvegyületből Eagle MEM médiumban 10 mg/ml koncentrációjú törzsoldatot készítettünk. A törzsoldat alikvot részét először tízszeresére, majd a kapott oldatot kétszeresére hígítottuk, utóbbi oldatból a kétszeres hígítást még kétszer ismételve a tesztvegyület rendre csökkenő koncentrációjú oldatát (1-5. sorszámú oldatok) állítottuk elő. A sejt-kezeléseket 1-1 ml oldattal végeztük, melynek hatóanyag tartalma az alábbi táblázat szerint volt: Az oldat sorszáma A hatóanyag koncentrációja pg/ml 1. 10 000 2. 1000 3. 500 4. 250 5. 125 A kezelést 1 órán keresztül végeztük, majd kétszer mostuk a tenyészeteket pufferolt sóoldattal (PBS=Phosphate buffered saline) és ezután tápfolyadékot adtunk a tenyészetekhez, és fénymikroszkóppal értékeltük a sejtek morfológiáját. Ebből megállapítható volt, hogy a tesztanyag csak 1000 mg/ml fölötti koncentrációban bizonyult toxikusnak. A vírus-szaporodást gátló hatás vizsgálatát az előzőekben leírt módon Hep 2 sejteken végeztük. A fertőzésre herpes simplex vírus 1. típusát használtuk. A vírus koncentrációja megközelítőleg 1000 PFU (plague forming unit) volt. A tesztvegyületből 1000, 500, és 250 ,ug/ml-es oldatokat készítettünk, melyekből 0,1 ml oldattal (tesztvegyület tartalom 500, 250 illetve 125 |ig) végeztük a kezelést úgy, hogy azokat a higítatlan vírusszuszpenzióhoz adtuk és az elegyet 1 órán keresztül 37 ”C-on inkubáltuk. Ezt követően a sejteket a tesztvegyülettel előinkubált vírussal kezeltük és 7 napig figyeltük a citopatológiás (továbbiakban CP) elváltozások kialakulását. Megállapítható volt, hogy a tesztvegyület 500 és 250 pg/ml dózisban a vírus szaporodását közvetlenül gátolja, a citopatológiás dózis infektív titer értéke (neg. log. CPD50) 0,1 ml-re vonatkoztatva 1,75 volt, míg a kezeletlen kontroll vírus tenyészet neg. log CPO50 értéke 4,5. A vírus gátlás értéke a kontrolihoz viszonyítva meghaladja a két nagyságrendet. Ugyanezen körülmények közt az EPA és DHA értékelhető vírusgátlást nem mutatott, míg a lizin önmagában akadályozta ugyan a vírus replikációt, de ennek mértéke a egy nagyságrend körül mozgott. A leírtakkal megegyező in vitro kísérletben vaccina vírust is kezeltünk. A tesztvegyület vaccina vírussal mért fentiekhez hasonló infektív titer értéke (neg. log. CPD50) 1,75 míg a kezeletlen kontroll vírusnál ezen érték 5,5 azaz a tesztvegyület a kontrolihoz képest három nagyságrendű vírusgátló hatású. A találmány szerinti vegyületek immunrendszerre gyakorolt in vitro hatását limfociták poliklonális mitogének hatására történő aktívációjával vizsgáltuk. Vizsgáltuk a limfociták blasztos transzformációját. A kísérletek során úgy jártunk el Fico Uromiro gradiensen (Scand. J. Gin. Lab. Invest 21, 97(1968) nyert limfocita sejtpopulációt lapos aljú lemezek mélyedéseibe pipettáztuk és a párhuzamos kultúrák mindegyikéhez 25 |ig/ml Concanavalin A-t (Con. A, gyártó Pharmacia Uppsala Sweden) majd a találmány szerinti vegyületek 0,1; 1,0 és 10 mg/ml koncentrációjú oldatát adtuk. Kontrollként tesztvegyület nélküli 25 pg/ml Concanavalin A-t tartalmazó kultúra szolgált. A lemezeket 72 órán keresztül 37 °C-on 5 % C02-ot tartalmazó atmoszférában tartottuk, de 64 óra után - a tenyésztés befejezése előtt - mindegyik mintához 0,4 pCi 3H-timidint adtunk. A kultúrákat 72 óra után üvegszűrőre szűrtük és a szűrőket szcintillációs küvettába helyezve toluolos oldatban béta sugárzást mérő számlálóval vizsgáltuk. Az eredményeket az alábbi táblázatban foglaltuk össze: Megnevezés Hatóanyag conc. (ua/a) percenkénti beütésszám (cpm) hatás értékelés kontroll 25 8969+2984 (Con. A.) 0,1 12.915±2045 + 1-tirozin 1,0 12.31312003 1-treonin 0,1 13.37112894-H-13.88311823 + 1-lizin 0,1 11.6311528-1,0 11.83311823 + co-3 zsírsav 0,1 12.33212235-elegy Na só 1,0 12.03911640-(1. pl. szerinti összetétel) kontroll 25 836912233 (Con. A) 16. pl. 0,1 14.96512143-H-tszerinti 1,0 12.51712195 -1. pl. szerinti 0,1 15.98512102 +++ termék 1,0 14.06811665 ++ kontroll 25 881612630 (Con. A) 13. pl. szerinti 0,1 650612545 — termék 1,0 511511890 — Jelmagyarázat:- gyengén csökkenő szignifikancia- nem szignifikáns + gyengén növekvő szignifikancia ++ szignifikáns növekedés +++ erősen szignifikáns növekedés A vizsgálatokból kitűnt, hogy a találmány szerinti vegyületek, de különösen a politelítetlen zsírsav elegy lizin és tirozin sója szignifikáns teszteredményeket 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
