199769. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mevalonolakton-analógok és származékaik, valamint ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199769 B 2 100 JJ.1 térfogatot kiveszünk fehérjemeghatározás céljára. Ehhez 1 ml 15 %-os kálilúgot adunk, majd a mintákat örvénylő keverésnek vetjük alá. A szappanosítást úgy tökéletesítjük, hogy az etanollal és kálilúggal kezelt mintákat vízfürdőben 60 ”C hőmér- 5 sékleten 60 percig hevítjük. Ezután a mintákat 2 ml desztillált vízzel hígítjuk, és háromszor 7 ml petroléterrel extraháljuk. A petroléteres kivonatokat egyesítjük, háromszor 2 ml desztillált vízzel mossuk, és nitrogénárammal szárazra pároljuk. 10 Az így kapott mintákat vékonyréteg-kromatográfiával a következőképpen elemezzük. A petroléteres extrakció lepárlási maradékát kis térfogatú hexánban felvesszük, és szilikagél-60 lemezre (E. Merck) cseppentjük. A kifejlesztést olyan oldószereleggyel végezzük , 15 amely 150 tértfogatrész hexánt, 50 térfogatrész dietilétert és 5 térfogatrész jégecetet tartalmaz. Három-fázisú kifejlesztő eljárást alkalmazunk. A detektálást jódgőzzel telített kamrában végezzük. A lemezeket öt részre osztjuk úgy, hogy egy-egy rész a következő, megkö- 20 zelítő Rf értékkel rendelkező anyagokat tartalmazza: 1. rész: 0-0,4; 2. rész: 0,4-0,55; 3. rész: 0,55-0,7; 4. rész: 0,7-0,9; 5. rész: 0,9-1,0. A 2. rész tartalmazza a nem szappanosítható (nem hidrolizáló) szterineket. A vékonyréteg-lemezek öt részét külön- külön szcin- 25 tillációs mérőedényekbe kaparjuk. Ezzel egyidőben vakpróbákat készítünk kromatografált, standardok segítségével. Hozzáadjuk az tillációs keveréket, és folyadék-szcintillációs spektrométerben meghatározzuk a minta radioaktivitását. A 30 szcintillációs számlálás hatékonyságának megítélése céljából 4C-hexadekán standardokat alkalmazunk. A minták összes fehérjetartalmát Bio-Rad Fehérje Mérőrendszer (Bio-Rad Portéin Assay System) alkalmazásával határozzuk meg. 35 Az eredményeket a minden egyes vékonyréteg-részen külön-külön megfigyelt bomlás/perc/fehérje-milligrammtömeg (d.p.m./mg- fehéije) értékekben fejezzük ki. Az átlagos d.p.m./mg-fejéije ± standard hiba értékeket összehasonlítjuk a százalékos változással 40 (A%), valamint az oldószeres kontrollok átlagértékeinek segítségével megállapítjuk a statisztikai szignifikanciát. A 2. vékonyréteg-rész adatait tekintjük a HMG-CoA reduktáz enzim- aktivitás gátlása mértékének. 45 „C” vizsgálat: az in vivo koleszterin-bioszintézis gátlásának mérése Az in vivo vizsgálatokhoz 150 ± 20 g testtömegű, hím Wistar Royal Hart patkányokat alkalmazunk. Az állatokat a vizsgálat előtt 7-10 napon át módosított 50 fényciklusban tartjuk (reggel 6 óra 30 perctől este 18 óra 30 percig sötétben tartózkodnak). Az állatokat ketrecenként párosával helyezzük el, poralakú „Purina” patkányeledelen tartjuk; vizet tetszés szerint fogyaszthatnak. A sötét ciklus közepén jelentkező, 55 napi maximális koleszterin- szintézis időpontja előtt három órával a patkányoknak beadagoljuk a vizsgálandó anyagot, amelyet előzőleg feloldunk, vagy pedig 1 ml/100 testtömeg térfogatban, 0,5 %-os karboximetil-cellulóz oldatban szuszpendálunk. A kontroll 60 állatokbak csak vivőanyagot adunk. A vizsgálandó anyag adagolása után egy órával a patkányoknak intraperitoneális úton körülbelül 25 (iCi/100 testtömeg-g mennyiségben 1-3 mCi/mmól mátrium-(l-l4C- acetát)-ot fecskendezünk be. A sötét ciklus felének 65 nern jelzett ACSR szcineltelte után két órával az állatoktól hexobarbitál-nátriummal előidézett narkózisban vérmintákat veszünk, és a szérumot centrifugálással elkülönítjük. A szérummintákat elszappanosítjuk, majd közömbösítjük, és a 3b-hidroxi-szterineket digitoninnal lényegében Sperry és munkatársai leírása szerint [J. Biol. Chem. 187, 97 (1950)] lecsapjuk. Ezt követően a 14C-digotonidokat folyadék-szcintillációs módszerrel mérjük. A hatékonysági korrekciók elvégzése után az eredményeket a 100 ml szérumban jelen lévő szterin nanocurie-ben (nCi) kifejezett aktivitása alapján számítjuk ki. A szterin- szintézis gátlását egyrészt a vizsgálati, másrészt a kontroll csoportok által szintetizált szterinek nCi értékeinek összehasonlításával állapítjuk meg. A fentiek alapján indokolt a találmány szerinti vegyületek vér- lipidszint-csökkentő és ateroszklerózis elleni szerekként való alkalmazása. Magas vér-lipidszint (hiperlipoproteinémia) és ateroszklerózis kezelése céljából a javasolt célszerű napi adag körülbelül 4-2000 mg, előnyösen 4-2000 mg, például - a hatékonyabb vegyületek esetében - 10-100 mg találmány szerinti vegyület, amelyet célszerűen 0,5-1000 mg, például 1-50 mg adagokra elosztva naponta 2-4 alkalommal vagy késleltetett felszabadulást biztosító (retard) formában adagolunk. Az (I) általános képletű vegyületek az ilyen indikációs területeken való felhasználás céljából javasolt, ismert vegyületekhez hasonlóan (amilyen például a kompaktin) adagolhatok. Egy adott vegyület esetében a célszerű napi dózis számos tényezőtől, így pélldául a vegyület relatív katékonyságától függ. Meghatároztuk például, hogy a 11. számú, előnyösen alkalmazható vegyület IC50 értéke az „A” vizsgálat szerinti 0,1 (imól; ugyanebben a vizsgálatban a kompaktin IC50 értéke 0,5 jimól. Indokolt tehát, hogy a találmány szerinti vegyületeket hasonló vagy kisebb dózisokban adagoljuk, mint azt általában a kompaktin esetében javasolják. (A kompaktin ajánlott adagja napi 25-150 mg.) A találmány szerinti vegyületek szabad sav formájában vagy fiziológiai körülmények között hidrolízisre hajlamos és fiziológiai szempontból elfogadható észtereik vagy laktonjuk, vagy gyógyászati szempontból alkalmas sóik alakjában adagolhatók. A találmány körébe tartozik a magas vér-lipidszint (hiperlipoproteinémia) és ateroszklerózis olyan kezelési módszere is, amelynek során egy (I) általános képletű vegyületet szabad sav vagy fiziológiai körülmények között hidrolízisre hajlamos, fiziológiai szempontból elfogadható észtere vagy laktonja, vagy gyógyászati szempontból alkalmas sója alakjában adagolunk; a találmány körébe tartozik továbbá e vegyületek gyógyszerként, például vér-lipidszint-csökkentő vagy ateroszklerózis elleni szerekként való alkalmazása. A találmány szerinti vegyületek önmagukban vagy gyógyászati szempontból elfogadható hígító-, vivő- és adott esetben más segédanyagokkal keverve adagolhatók orálisan - például tabletták, elixirek, kapszulák vagy szuszpenziók alakjában - vagy parenterálisan, például befecskendezésre alkalmas oldatok vagy szuszpenziók formájában. Az előnyös gyógyszerkészítmények mind az előállítás könnyedsége, mind az adagolás célszerűsége 13
