199769. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mevalonolakton-analógok és származékaik, valamint ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199769 B 2 dalomban a hasonló szerkezetű, ismert vegyületekre leírt módszerekhez hasonló eljárásokkal előállíthatók. Az (LV) általános képletű vegyület egyik izomerjét Yang és munkatársai közölték [Tetrahedron Letters 23, 4305 (1982)]: a másik izomer szintézisét a IV. reakció vázlat mutatja. A Yang és munkatársai által ismertetett izomer és a IV. reakcióvázlatban feltüntetett izomer 4R,6S konfigurációjú laktonokhoz vezet A 4S,6S konfigurációjú laktonok a másik izomerből állíthatók elő, amelynek szintézise a IV. reakcióvázlatban bemutatott szintézishez hasonlóan történhet. Ezen közbenső termékek lehetővé teszik az optikailag tiszta végtermékek szintézisét. (Ld. 8. pl. 4. lépés ill. I, reakcióvázlat) Mind a közbenső, mind a végtermékek a szokásos módon elkülöníthetők és tisztíthatok; megfelelő esetekben a közbenső termékek a következő reakciókhoz közvetlenül felhasználhatók. A sztereoizomerek (cisz, transz és optikai izomerek) keverékei a szokásos módon a szintézis bármelyik, alkalmas lépésében felbonthatók. E célra megfelelő módszerek például az átkristályosítás, kromatográfia, észterek képzése optikailag tiszta savakkal és alkoholokkal, vagy savamidok és sók előállítása [lásd még: Sommer és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 80, 3271 (1958)], amit követ a megfelelő komponenssé való visszalakítás az optikai tisztaság (egységesség) megtartása mellett. így például az (I) általános képletű laktonok diasztereomer (-)-a-naftil-fenil-metil-szilil-származékai a szokásos eljárásokkal elkülöníthetők. A sókat a szabad savakból, laktonokból és észterekből a szokásos módon állíthatjuk elő és viszont. Jóllehet a találmány az összes sókra vonatkozik, ezek közül a gyógyászati szempontból alkalmas sók, különösen a nátrium-, kálium- és ammóniumsók, főként a nátriumsók előnyösek Az (I) általános képletű vegyületek különböző formái - egymásba való átalakíthatóságuk következtében - alább kifejtett alkalmazásukon kívül közbenső termékekként is felhasználhatók. Az (I) általános képletű vegyületek farmakológiai hatással rendelkeznek: gátolják a 3-hidroxi-3-metilglutaril-koenzim A (HMG-CoA) reduktáz enzimet, s ennek következtében gátolják a koleszterin bioszintézisét. Ezt igazolható a következő három vizsgálattal. „A” vizsgálat: a HMG-CoA reduktáz enzim gátlásának „in vitro” mikroszómás mérése 150-225 g testtömegű hím Sprague-Dawley patkányokból frissen készített máj-mikroszóma-szuszpenzió 200 pl alikvot részeit (1,08-1,50 mg/ml) A pufferoldatban 10 mmól ditio-treittel együtt dimetil-acetamidban oldott 10 pl vizsgálandó anyaggal inkubálunk, és a HMG-CoA reduktáz enzim aktivitását az Ackerman és munkatársai által leírt módszerrel [J. Lipid Res. 18, 408 (1977)] méijük. E vizsgálatban a mikroszómák jelentik a HMG-CoA reduktáz enzim forrását, amely a HMG-CoA mevalonáttá való redukcióját katalizálja. A vizsgálat során a 14C-HMGCoA szubsztrátumból a HMG-CoA reduktáz enzim hatására képződő 14C-mevalonolaktont kloroformmal extrahálva elkülönítjük. Belső standardként 3H-mevalonolaktont adunk az elegyhez. A HMG-CoA reduktáz enzim gátlását a 14C/3H-mevalonát fajlagos aktivitásának csökkenéséből számítjuk ki a vizsgálati csoportok és kontrollcsoportok értékeinek összehasonlításával. „B” vizsgálat: az in vitro sejttenyészetben végbemenő koleszterin-bioszintézis mérése A sejttenyészetet a következő módon készítjük: patkány-hepatoma Fu5AH sejttörzs egyrétegű („monolayer”) tenyészetét [ezt eredetileg G. Rothblat-tól kaptuk; lásd G. Rothblat: Lipids 9, 526 (1974)] rutinszerű módon Eagle-féle esszenciális minimál-táptalajon tartjuk, amelyet 10 %-os szarvasmarha-magzatszérummal egészítünk ki (e műveletet 75 cm2 felületű szövettenyésztő edényekben végezzük). Vizsgálataink céljára, ha a tenyészetek egybeolvadnak, azokat enyhe, 0,25 % tripszint tartalmazó Hanks-féle egyensúlyozott sőoldattal (kálcium és magnézium nélkül) végzett enyhe enzimes kezelés útján eltávolítjuk. A sejtszuszpenziót centrifugáljuk, az enzimet tartalmazó oldatot leszívjuk, és a centrifugált sejtkalácsot 60 mm átmérőjű, sejttenyésztő csészékben való oltásra megfelelő térfogatú közegben ismét szuszpendáljuk. A tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten magas nedvességtartalmú, 5 % szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában inkubáljuk. A sejttenyészetek felhasználásra készek, amikor összefolynak (körülbelül 5 nap elmúltával). A táptalajt a csészékről leszívjuk, és 3 ml esszenciális minimál-táptalajjal helyettesítjük, amelyet 5 mg/ml lipidmentesített szérumfehérjével egészítünk ki [ennek előállítását Rothblat és munkatársai módszerével végezzük: In Vitro 12, 554 (1976)]. A szarvasmarha- magzatszérum lipidmentesített szérumfehéijével való helyettesítése - amint ezt kimutatták - elősegíti a 14-C acetátnak a szterinbe való beépülését, a szarvasmarha- magzatszérum exogén szterinjének eltávolítása következtében, s ezáltal a sejteket szterin szintézisre serkenti. A 3-hidroxi-3-metil-glutaril koenzim (...) A reduktáz (MHG-CöA reduktáz) enzim aktivitásának növekvése a sejtekben mérhető: ez az exogén szterin hiányára adott sejtválasz. 37 °C hőmérsékleten végzett, mintegy 24 órás inkubálás után (a lipidmentesített szérumfehérjével kiegészített közegben) megkezdjük a mérést 3 pCi 14C-acetát hozzáadásával. A vizsgálandó anyagot dimetil- szulfoxidban vagy desztillált vízben oldjuk. Minden esetben kontrollokat készítünk egyrészt az oldószerből, másrészt kompaktinnal való kezelés segítségével. Minden egyes csoportban három ismétlésben 60 mm átmérőjű szövettenyésztő csészékkel dolgozunk. 37 °C hőmérsékleten 3 órán át végzett inkubálás után a tenyészeteket mikroszkóposán vizsgáljuk fordított fázisú kontraszt-mikroszkóp alkalmazásával. A tenyészetekben végbement minden morfológiai változást feljegyzünk. A közeget leszívjuk, és a sejtréteget 0,9 %-os fiziológiás konyhasóoldattal kétszer enyhén átmossuk. Ezután a sejtréteget lekaparva 3 ml 0,9 %-os konyhasóoldaban összegyűjtjük, és tefondugós, tiszta üvegcsőbe helyezzük. A csészéket 3 ml 0,9 %-os konyhasóoldattal ismételten ledörzsölve öblítjük, és az így kapott oldatot az előbbivel egyesítjük. A csöveket percenként 1500 fordulatszámmal 10 percig egy IEC PR-J típusú centrifugában centrifugáljuk, és a felülúszót elkülönítjük. Ezt követően a sejteket a következőképpen extraháljuk: 1 ml 100 %-os etanolt adunk a sejtkalácshoz, majd 10 másodpercig Bronwell Biosonik IV „LO” 50 készülékkel ultrahangkezelést végzünk. Ezután 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
