199630. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 11-deoxi-13,14-dihidro-15-keto-11b,16E-cikloprosztaglandin E2 tartalom radioimmunológiai meghatározására és az ehhez alkalmazott jód-125 izotóppal jelzett radioligandum előállítására
HU 199630 B tot adunk, és a csöveket előbbi módon keverjük. Sorszámozott műanyag kémcsövekbe automata pipettával a standard és a minta oldatokból 100—100 mikrolitert bemérünk, majd hozzáadunk 100 mikroliter l25I-bicikIo-PGEM-TME tracert, amelynek radioaktivitása 30000—40000 cpm/100 mikroliter, és 100 mikroliter specifikus antiszérumot olyan hígításban, amely a tracer 30—60%-át képes megkötni. Valamennyi kémcsőbe, amely nem a mérendő mintákat tartalmazza, bemérünk 100 mikroliter a mintákkal azonos hígítású de lúggal nem kezelt nyúlplazmát, mely hatóanyagmentes plazmaháttérként szolgál. A nem-specifikus kötődés (NSB) meghatározására további kémcsövekbe az antiszérum helyett 100 mikroliter tiszta pufferoldatot teszünk. A Bo/T és TC érték méréséhez szükséges csövekbe, valamint az NSB — csövekbe a standardokkal együtt kezelt „0“-standard oldatból pipettázunk 100 mikrolitert. A vérminták meghatározásához szükséges plazmamintákat úgy kapjuk, hogy a vért műanyag kémcsövekbe, 0,1 térfogatrész — 2% etilén-diamin-tetraecetsav-dinátriumsót és 1 mmol indomethacint tartalmazó — izotóniás sóoldatra vesszük, majd azonnal 4°C-on, 10 percig, kb. 1000 x g gyorsulással centrifugáljuk, és a tiszta plazmát különválasztjuk. A centrifugálás és a mintavétel közötti időben a vért jeges fürdőben tartjuk. Ugyanúgy nyerjük a kalibrációs görbéhez háttérként szükséges hatóanyagmentes vérplazmát, de itt több állatból származó vérplazmából keveréket készítünk. A térfogat valamennyi kémcsőben a művelet végén 0,4 ml lesz. A tracer és az antitest oldásához, valamint a térfogatkiegészítéshez szükséges pufferként 50 mM koncentrációjú 7,4 pH-jú 0,1% zselatint tartalmazó foszfát puffert használunk. A kémcsövek tartalmát néhány másodpercig kevertetjük, majd lezárjuk, és hűtőszekrényben 4°C körüli hőmérsékleten egy éjszakán át állni hagyjuk. Ezután a TC csövek kivételével minden kémcsőbe folyamatos keverés közben 2—3 perc alatt bepipettázunk 0,5 ml — 0,5% Dextran T-70-et (Pharmacia, Svédország) és 1% csontszenet (Norit-A, Serva NSZK) tartalmazó — 0,01 mólos, 7,4 pH-jú foszfát puffer szuszpenziót, a TC csövekbe pedig azonos térfogatú RIA-puffert. A csöveket az előbbiek szerint kevertetjük, majd 0°C-on, 10 percig, 2000 x g gyorsulással centrifugáljuk, és a felülúszókból alkalmas mérőcsövekbe 0,5—0,5 ml-t pipettázunk, majd mérjük ezek radioaktivitását Nal(Tl) szcintillációs kristállyal ellátott automatikus minta — váltó berendezésben (pl.: Minigamma, LKB Svédország gyártmány). A számítást a radioimmun meghatározásokban szokásos módon végezzük. A fentiekből a szakember felmérheti a találmány előnyeit a technika állásához képest. Az előnyökből kiemeljük: 7 Az alkalmazott radiokémiái szintézis segítségével kedvező feltételek között előállíthatunk olyan radioligandumot, nevezetesen az (I) képletű 125I-biciklo-PGEM-TME származékot, amelynek nagy moláris aktivitása biztosítja a biciklo-PGEM (illetve PGEM) koncentrációjának az eddig használt triciummal jelzett tracerhez képest mintegy tízszer érzékenyebb radioimmunológiai meghatározását. Az alkalmazott adszorpciós oszlopkromatográfiás elválasztástechnika biztosítja a jódjelzett célterméknek a kiindulási anyagtól való tökéletes elválasztását, és ezáltal a céltermék fajlagos aktivitása nem csökken a reakció során. Az alkalmazott szintézis, amelynek célja a PGEM alapmolekulának jódjelzésre alkalmas oldallánccal való kapcsolása, nem változtatja meg a PGEM alapmolekula immunológiai tulajdonságát (azaz a specifikus antitesthez való kötődésének egyensúlyi állandóját), ezáltal „heterológ assay“-re alkalmassá válik. Az alkalmazott elválasztástechnika a más források által ismertetett elválasztási módszerekkel szemben a radiojódos jelzés során nagyobb aktivitásmennyiségeknél is biztosítja a szükséges sugárvédelmet, és minimálisra csökkenti a radioaktív inkorporáció veszélyét. Mindezek alapján a találmány szerinti új, jód-125 izotóppal jelzett radioligand alkalmazása olyan biciklo-PGEM radioimmunoassay megvalósítását teszi lehetővé, amely megőrzi a homológ assay specificitását, de többszörösére növeli annak érzékenységét, miközben a szükséges méréstechnika egyszerűbbé, gyorsabbá és olcsóbbá válik, és jelentősen csökkenthető a méréshez szükséges antitest mennyisége is. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás biológiai szövetminta 13,14-dihidro-15-keto-PGE2 (továbbiakban PGEM) tartalmának antigén-antitest reakción alapuló meghatározására, a PGEM kémiailag stabil származékán, 1 l-deoxi-13,14-dihidro-15-keto-1 lB,16E-ciklo-PGE2 (továbbiakban biciklo-PGEM) mérésén keresztül ismert mennyiségű, hígítási sorozat szerint különböző koncentrációjú biciklo-PGEM és a biológiai szövetminta jelenlétében, amelynek során ismert mennyiségű, hígítási sorozat szerint különböző koncentrációjú PGEM-et és a meghatározandó biológiai minták PGEM-hatóanyagát lúgos kezeléssel biciklo-PGEM-mé alakítjuk, majd megmérjük nagy fajlagos aktivitású radioaktív nyomjelző vegyületnek (továbbiakban tracer) specifikus antitesttel való kötődését, és az ismert mennyiségű biciklo-PGEM hígítási sorozat által okozott kötésváltozás alapján számítjuk a mindenkori szövetminta hatóanyagtartalmát, azzal jellemezve, hogy tracerként (I) képletű i25I-biciklo-PGEM-tirozin-metilészter származékot alkalmazunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként olyan anti-bicik-8 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
