199562. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás glükóz izomerizálására
HU 199562 B miailag stabilizált izomerázt tartalmaz. A kémiailag stabilizált izomerázt úgy állítjuk elő, hogy az enzimet valamilyen (például élesztőből származó) védőfehérjével reagáltatjuk. Az alacsony hőmérsékletű izomerizálási 5 lépést — beleértve a tápoldat és a kísérleti körülmények leírását is — az 1. példában ismertettük. A magas hőmérsékletű reaktorban alkalmazott, kémiailag stabilizált glükóz-izomeráz enzimet a következő módon állítjuk elő: A kémiai stabilizáláshoz az oldható glükóz-izomeráz enzimet az 1. példában leírt módon állítjuk elő és tisztítjuk. E készítmény aktivitása körülbelül 40 IGIU/mg protein. A védőfehérjét sütőélesztőből állítjuk elő a következőképpen: 1229 g nedves sütőélesztő-masszához 1000 g vizet és 500 g toluolt adunk. A keveréket egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, majd 85°C-ra melegítjük, és körülbelül 30 percen át ezen a hőmérsékleten tartjuk. Ezután a keveréket Büchner-tölcséren leszűrjük. A toluol csaknem teljes mennyiségben visszamarad az oldhatatlan sejttőrmelékben, és a vizes szűrlet tartalmazza az oldható élesztő-extraktumot. A vizes szűrlétét forgó bepárlóban, 40°-on 267 g-nyira pároljuk be, majd keverés közben 41 g triklór-ecetsavat adunk hozzá. A kicsapódott élesztőfehérjét összegyűjtjük, majd 0,1 mólos (pH=7,0) nátrium-foszfát pufferoldatban ismét feloldjuk. Az oldatot szűréssel történő tisztítás után 900 ml (kb. 3-szoros térfogatú) acetonnal kezeljük. A csapadékot összegyűjtjük, 0,01 mólos (pH=7,0) nátrium-foszfát pufferoldatban oldjuk, majd a kapott oldatot 0,01 mólos nátrium-foszfát pufferoldattal dializáljuk. Az így kapott terméket (150 ml) sűtőélesztőből előállított védőproteinnek nevezzük. 0,6 t%-os citozánoldatot készítünk úgy, hogy 24 g citozánt (Kytex, a Hercules Inc. cégtől, Wilmington, Delaware) 41iter 0,08 N sósavban oldunk. Az oldat pH-ját 8 N nátrium-hidroxiddal beállítjuk 6,2-re, Whatman 3-as szűrőpapíron leszűrjük, majd 16 liter ionmentesített vízzel dializáljuk. 400 ml-es főzőpohárba körülbelül 100 000 IGIU oldott (szűrési segédanyaggal kevert) glükóz-izomeráz enzimet, 1 g xilitolt és 100 ml (2/3), sütőélesztőből előállított védőfehérjét teszünk. Hozzáadunk még 2,4 mg MgS04-7H20-t és 24 mikroliter moláris kobalt-klorid-oldatot. A keveréket 23 a szűrési segédanyag eltávolítása céljából leszűrjük, 2 literes lombikban 40°C-on, forgó bepárlóban csaknem szárazra pároljuk, majd pH=6,5-re beállított glutáraldehid-oldatból 640 mikrolitert adunk hozzá. A keveréket egy éjszakán át hideg helyen tároljuk. Ezután a gélt eltávolítjuk a lombikból, 0,55 mm lyukbőségű szitán átnyomjuk, majd szárítószekrényben körülbelül 37°G-on meg- 10 szárítjuk. A száraz enzimkészítmény poros részét 0,177 mm lyukbőségű szitával eltávolíjuk, a kapott 8,9 g végterméket használjuk a magas hőmérsékletű izomerizáláshoz. 15 A 103,3°C-os reaktort a következőképpen készítjük: A fenti (8,9 g) glükóz-izomeráz készítményt tápoldatban szuszpendáljuk, majd laboratóriumi vákuummal, szobahőmérsékleten 30 percen át légtelenítjük. A légte- 20 lenített szuszpenzióból 1,5X29 cm-es töltetet készítünk egy köpennyel ellátott üvegcsőben. A 70°C-os első fázisú izomerizálással kapott tápoldat pH-ját 6,75-re állítjuk be, majd 42,0 t% szárazanyagtartalomra hígítjuk. 25 Ezt a táptalajt azután 60°C-on, körülbelül 1,5 ml/perc sebességgel 30 percen át,keringetjük a magas hőmérsékletű reaktoroszlopban. Az oszlop hőmérsékletét egy — közvetlenül a töltet felett elhelyezett — hőmérő 30 mutatja, melyet 0,5 cm-es üveggyöngyökkel veszünk körül, hogy a holtteret a lehető legkisebbre csökkentsük. Az oszlop hőmérsékletét ezután gyorsan növeljük a köpenyben cirkuláltatott olajjal, melyet 104°C-os fürdő- 35 ben termosztálunk. Az oszlopból elvezetett folyadékot regisztráló polariméterrel figyeljük, mely 50 és 58% közötti fruktóztartalomra van beállítva. A körülbelül 5 ml-es frakciókat addig gyűjtjük, 40 míg a fruktóztartalom eléri vagy meghaladja az 55 t%-ot, és ezen a ponton a kísérletet befejezzük. A minták gyűjtése során az elvezetett folyadékot jégfürdőben azonnal lehűtjük, és 0,1 moláris citromsav, majd pedig híg sósavoldat hozzáadásával 4,0-re állít- 45 juk be a pH-ját. A 70°C-os és a 103,3°C-os reaktorban kapott izomérizált oldatokat szénhidrát-összetételre és színre elemezzük, és az eredmé- 50 nyékét összehasonlítjuk az izomerizálatlan tápoldatban végzett hasonló elemzések eredményeivel, amint az az alábbi 4. táblázatból látható. 24 13
