199562. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás glükóz izomerizálására
nu lyyooz o 25 26 4. Táblázat A 70 °C-on és a 103«3 °0-on izomerizált tápoldatot összetétele Szénhidrát összetétel tömeg.% hamumentes szárazanyagra számítva/ Szín /CDU? Az oldat kezelése Fruktóz Glükóz Pszikóz Poliszacharid X100/ Izömer1zálatlan 0 97,6 0 2,4 0,5 70 °C-cn izomerizált 51,3 46,4 0 2,3 0,7 103,3 °C-oh izomerizált 56,3 41,5 0,1 2,2 34,0 Az eredmények azt mutatják, hogy £6,3 t% fruktóztartalmat értünk el, miközben a pszikóztartalom — szárazanyagra számítva — 0,2 tömeg% alatt maradt. 5. Példa Ez a példa egy lényegében kukoricakeményítő-hidrolizátumból álló, glükóztartalmú, alacsony sókoncentrációjú oldat közvetlen izomerizálását mutatja be kétfázisú eljárással, szárazanyagra számítva 55,4 t% fruktóztartalmú készítmény előállítása céljából. Először 70°C-on alacsony hőmérsékletű izomerizálást hajtunk végre, majd e reakció termékét bevezetjük a második, magas hőmérsékletű reaktorba (112,6°C), mely kémiailag stabilizált izomerázt tartalmaz. A kémiailag stabilizált izomerázt úgy állítjuk elő, hogy az enzimet több ponton, kovalens kötésekkel egy oldható polimerhez kapcsoljuk, majd oldhatatlanná alakítjuk, hogy megkapjuk a kötött katalizátort. A hidrolizátumot kukoricakeményítőből állítjuk elő a 3,644,126 és 3,280,006 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetett módszerekkel (elfolyósítás, illetve elcukrosítás). Az elcukrosított folyadékot a 3,843,940 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint finomítva olyan terméket kapunk, mely szárazanyagra számítva 93,8 t% glükózt tartalmaz. Megfelelő menynyiségű kristályos glükóz hozzáadásával az összes glükóztartalmat (szárazanyagra számítva) 96,9 t%-ra növeljük. Az így kapott oldat összetétele a következő lesz: összes szárazanyag (t%) 50,3 Glükóz (t%, szárazanyagra) 96,9 Fruktóz (t%, szárazanyagra) 0,1 Poliszacharid (t% szárazanyagra) 3,1 Pszikóz (t%, szárazanyagra) 0,0 14 Nátrium-hidroszulfát (mM) 2,5 Magnézium-szulfát (mM) 2,5 Kobalt-klorid (mM) 0,1 PH 6,8 Az alacsony hőmérsékletű izomerizálást 70°C-on végezzük oly módon, hogy a fenti 30 tápoldatot 2,5 ml/perc sebességgel keringetjük az alacsony hőmérsékletű reaktorban az 1. példában leírt módon. A reaktorból távozó első 1000 ml folyadékot elöntjük. Az ezután távozó folyadékot összegyűjtjük 35 a második, magas hőmérsékletű izomerizáláshoz. A magas hőmérséklétű reaktorban használt, kémiailag stabilizált katalizátort a következőképpen készítjük: Az oldható izome- 40 rázt az első példában leírt módon állítjuk elő és tisztítjuk. E készítmény aktivitása körülbelül 40 IGIU/mg. Az oldható polimer oldatát úgy készítjük, hogy 48,4 g citozánt (poliamin, Kytex, a Hercules Inc. cég termé- 45 ke, Wilmington Delavare 198999) 15 liter 0,08 N sósavban oldunk. 438 g nátrium-klo* rid hozzáadásával a citozánoldatot nátrium-kloridra nézve 0,5 mólossá tesszük, majd 6,1-re állítjuk be a .pH-ját 8 N nátrium-hid- 50 roxid-oldat hozzáadásával. Ezután a nem oldódó anyagok eltávolítása céljából az oldatot Whatman 3-as szűrőpapíron leszűrjük. A citozánra 0,3 t%-os, nátrium-kloridra 0,5 mólos, 6,1 pH-jú oldathoz a következő anya- 55 gokat adjuk: 520 ml oldható izomeráz, mely körülbelül 602 000 IGIU aktív anyagot tartalmaz, 236 g xilitol (Sigma Chemical Co.) és 3,07 g MnCl2-4H20. Ezt az oldatot 2 órán át keverjük, majd 7,44 g l-etil-3-dimetil-ami- 5Q no-propil-karbodiimidet (Sigma Chemical Co.) adunk hozzá, hogy az izomeráz karboxilcsoportiai és a citozán aminocsoportjai között töDb ponton kovalens kötések alakuljanak ki. 2 óra elteltével szobahőmérsékleten 15,5 ml 50 tömeg%-os glutáraldehid-ol®5 datot (Eastman Kodak Chemical Co.) adunk
