199559. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 10255 antibiotikum komplex és faktorai, valamint ezeket tartalmazó készítmények előállítására
HU 199559 B torokat tartalmazó összeöntött frakciókat egyesítjük, az oldatok kémhatását 5n nátrium-hidroxiddal pH=6,0 értékre állítjuk be, azonos térfogatú vízzel hígítjuk (össztérfogat: 26 liter), és két különálló futtatásban kromatográfáljuk, 13 litert alkalmazva egy kromatografálásnál. Ezeket a kromatografálásokat ugyancsak a Waters Prep 500 C18 készoszlopán végezzük. A lineáris grádiens létrehozásához 4 liter 0.,05n ammónium-acetát (pH=5,5)/acetonitril, 75:25 összetételű oldatot adagolunk 4 liter 0,05n ammónium-acetát oldat (pH=5,5)/acetonitril, 60:40 öszszetételű B. oldathoz, majd a kromatografálást 2 liter B_ oldattal folytatjuk. Átfolyási sebesség 250 ml/perc; percenként egy frakciót gyűjtünk. A főként G faktort tartalmazó frakcókat egyesítjük, azonos térfogatú víz-, zel hígítjuk, és újra kromatográfáljuk C18 készoszlopon Prep 500 készülékkel. Ekkor a lineáris grádiens kialakításához 4 liter víz/ /acetonitril/tetrahidrofurán/ecetsav, 70:30: :5:0,5 összetételű A_ oldatot adagolunk 4 liter 65:35:5:0,5 összetételű B. oldathoz. Átfolyási sebesség percenként 250 ml. A csak G faktort tartalmazó frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson vizes oldatig bepároljuk. A kicsapódó G faktort centrifugálással elválasztjuk, vízzel mossuk, vízben szuszpendáljuk, és fagyasztva szárítjuk, 686 mg G faktort nyerve. A termék fizikai állandóit a leíró részben ismertettük. 9. példa Az A10255H faktor elválasztásához a 2. példa alapján nyert antibiotikum komplex 1,0 grammját feloldjuk 2 liter víz/acetonitril, 4:1 elegyében, pH=5,0 kémhatásnál, majd szűrőtölcsérben üveggyapott rétegen átszűrjük. A szűrletet egy Waters Prep 500 készülék C18 készoszlopára visszük. Az oszlopot lineáris grádiens elúcióval eluáljuk, 4 liter víz/acetonitril/tetrahidrofurán/ecetsav, 70:30:5:0,5 összetételű A. oldatot adagolva 4 liter viz/acetonitril/tetrahidrofurán/ecetsav, 70:30:5:0,5 összetételű B oldathoz. Az átfolyási sebesség percenként 250 ml. Percenként gyűjtünk egy frakciót. A grádienst követően az oszlopot még további 2 liter B. oldattal eluáljuk. Az eluátumot 280 nm-en detektáljuk. Tizenhárom azonos kromatografálás H faktort tartalmazó frakcióit egyesítjük, a kapott 17 liter oldatot bepároljuk, a maradékot csökkentett nyomáson szárítjuk, 690 mg nyers H faktort nyerve. Ezt az anyagot egyesítjük 329 mg azonos preparátummal,. és feloldjuk 3 liter víz/acetonitril/tetrahidrofurán, 70:20:5 elegyben, pH=6,0 kémhatásnál. Az oldatot a fent említett C18 készoszlopra viszszük. A kromatografáláshoz használt lineáris grádienst 4 liter 0,05M ammónium-hidroxid/acetonitril, 75:25 összetételű A_ elegynek 4 liter víz/acetonitril/tetrahidrofurán/ /ecetsav, 60:40:5:0,5 összetételű B. elegyhez való adagolásával kialakítva. Percenként 57 30 250 milliliteres frakciókat gyűjtünk. A H faktort tartalmazó 23—29. frakciókat egyesítve, a térfogatot csökkentett nyomáson 450 ml-re pároljuk be. A kicsapódó H faktort szűréssel összegyűjtjük, vízzel mossuk és csökkentett nyomáson szárítjuk, 285 mg H faktort nyerve. A termék fizikai állandóit a leíró részben ismertettük. 10. példa A szarvasmarhák növekedését serkentő tápkészítmény összeállításához az A10255 komplexnek vagy egyes faktorainak hatékony mennyiségét hozzákeverjük az állatok eleségéhez. Egy szokásos takarmánykeverék összetétele például a következő: kukoricasiló (teljes növény, teljes csövekkel) 50% nagy nedvességtartalmú kukorica 44% adalékanyag 6% ahol az adalékanyag a következő alkotórészekből áll: lucernaliszt (dehidrált, 58 17%-os) 12,00% szójaliszt (oldószerrel extrahált) 43,40% karbamid, tápminőségű 5,00% dikálcium-foszfát 8,00% só 10,00% kálcium-karbonát 11.00% nyomelem premix 0,80% A + D3 vitamin premix 1,40% E vitamin premix 1.40% kálium-klorid 5,00% Etetés előtt a takarmányt A10255 komplexet tartalmazó premixxel keverjük össze. A premix az alábbi összetételű: sárga kukorica 48,00% grit-0-cobs 20/40 50,00% ásványi olaj 2,00%. A premixhez először hozzáadjuk az adagolás sebessége által meghatározott A10255 komplex mennyiségét, például naponként és fejenként 275 vagy 550 mg-ot (mely ebben a példában tonnánként '28,6 és 61,7 grammot jelent). Az A10255 komplexet tartalmazó premixet hozzáadjuk a fenti eleséghez és összekeverjük. Naponként és fejenként 0,16 g premixet adunk az állatoknak. 11. példa Az A10255 antibiotikumot termelő mikroorganizmust. az alábbi összetételű táptalajt tartalmazó ferdeagaron növesztjük ki: előfőzöt zabliszt 60 g élesztő 2,5 g dikálium-hidrogén-foszfát 1,0 g kálium-klorid 0,5 g magnézium-szulfát-7 víz 0,5 g vas(II)-szulíát-7 víz 0,1 g ionmentes vízzel kiegészítve 1 literre. A táptalaj kémhatását pH= 7,3 értékre állítjuk be nátrium-hidroxid vizes oldatával. A táptalajt autoklávban sterilizáljuk, mely alatt a kémhatása pH= 6,7 értékre változik. A fenti táptalajt tartalmazó ferdeagart S.gardneri NRRL 15922 törzs spóráival olt-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 05
