199558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz izomeráz enzim tisztítására
13 HU 199558 B 14 III. táblázat Vegyület szám Csapadék Oldható aktivitás IGIU A csapadék visszaoldása utáni aktivitás IGIU összes IGIU 1 +++ 101 1422 1523 2 + 1772 — 1772 3 + 664 — 664 4 +++ 58 278 336 5 +++ 182 722 904 6-1820 — 1820 7 +++ 8 272 280 8 ++ 1064 722 1786 9-1974 — 1974 Kontrol — . 1980 1980 A négy vegyület mindegyike (az 1., 4., 5. és 7. számmai jelöltek), amely a legbőségesebb csapadékot adta, tartalmaz N-benzil szubsztituenst. A 8-as számmal jelölt BTC-812, amely két hosszú alkil-láncot tartalmaz, olyan csapadékot képez, amely fizikailag különbözik a BTC-835 adta csapadéktól és a többi csapadéktól is. Ez esetben az aktivitás visszanyerése kiváló volt. A 6 és 9 számokkal jelölt vegyületek nem adtak csapadékot és igen kicsi enzim inaktivációt okoztak. A 3., 4. és 7. számokkal jelölt vegyületek jelentős aktivitásveszteséget okoztak. 6. példa A példában azt illusztráljuk, hogy egy enzim és egy kvaterner ammonium vegyület oldhatatlan komplexe enzimatikusan aktív. A 4. példa szerint előállított • izomeráz extraktumból egy minta pH-ját pH=7,2 értékre állítjuk be, 1500 ppm BTC-835-tel kezeljük, szűrési segédanyaggal keverjük és az oldhatatlan anyagot szűréssel összegyűjtjük. A szűrőpogácsát vízzel mossuk és a szűrletet összekeverjük. Kiveszünk egy mintát és a FAU módszerrel megmérjük a fix izomeráz aktivitást. Az eredmények kifejezett aktivitást mutatnak, amely a kiindulási oldható aktivitás 29%-a. 7. példa A példában egy olyan alternatív eljárást írunk le, amelyben erősen savas kationcse-8 rélő gyantát használunk a BTC-nek az újra feloldott izomeráz BTC csapadékokból való 35 eltávolítására. Elkészítünk egy részlegesen tisztított izomeráz koncentrátumot oly módon, hogy egy nyers enzim extraktumot Amion CH4 koncentrátorral, HIP100 töltet (100 000 MWCO) 40 felhasználásával ultraszűrjük. Az ultraszűrés elfolyó folyadékát 5 térfogatnyi ionmentesített vízzel diafiltráljuk, ezzel eltávolítjuk az alacsony molekulasúlyű feloldott anyagok maradékát is. A végső koncentrátum ak- 45 tivitása 2175 IGIU/ml, a proteinkoncentráció pedig 66,9 mg/ml. (A fajlagos aktivitás 32,5 IGIU/mg.) Ebből a koncéntrátumból 10 ml-es részt 50 kiveszünk, ezt 300 ml vízzel meghígítjuk és pH-ját 7,2 értékre állítjuk be. Ehhez az oldathoz 300 .mg BTC-835-öt adunk és a' kapott szuszpenziót 30 percig keverjük. A képződött csapadékot centrifugálással elkülönít- 55 jük, majd 25 ml 0,5 M nátrium-klorid oldatban újra feloldjuk. Ehhez az oldathoz 1 g nedvës AG50 W X4 kationcserélő gyantát adunk (Bio Rád Laboratories, Richmond, CA gyártmány, nátriumos alakban). A pH-t 7,0 értékre állítjuk be és a szuszpenziót 30 per- 60 cig erőteljesen keverjük. Ezt követően a gyantát hagyjuk leülepedni, és a felülúszó folyadék egy alikvot mennyiségét U.V. analízissel megvizsgáljuk az oldható proteink (abszorbció 280 nm-nél) és BTC (abszorbció 262 nm- 65 nél) szempontjából. Az U.V. analízis az oldha
