199558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz izomeráz enzim tisztítására
11 HU 199558 B 12 II. táblázat Kísérlet /BTC/ ppm 1 1000 2 2000 3 3000 4 5000 Oldható izomeráz aktivitás IGIU/ml Összes IGIU 259 44 44 53 Oldható fázis, % /555 IGIU összesen/ 46,6 7.9 7.9 9,5 10,36 1,76 1,76 2,10 A BTC hozzáadása, 1500'ppm-nyi mennyiséggel való előkezelés után, amit a nem-enzim szennyeződések eltávolítása céljából végzünk, 2000 ppm vagy ennél nagyobb BTC koncentrációnál csaknem teljes oldható izomeráz aktivitás veszteséget eredményez. 1000 ppm hozzáadása az oldható aktivitás körülbelül felének kicsapódását eredményezi. A fenti kísérletekből nyert csapadékokat 10 ml 0,5 N nátrium-kloridban szuszpendáljuk. A csapadékok gyorsan újra feloldódnak. A feloldott csapadékokat tartalmazó oldatokat dekantáljuk és XM-50 membránnal ultraszűrjük. 0,5 N nátrium-kloriddal és vízzel való diafiltrálás után az elfolyó folyadékot megvizsgáljuk izomeráz aktivitás és proteinkoncentráció szempontjából. A visszanyert összes aktivitás érték 1103 IGIU. A fajlagos aktivitás 4,16 IGIU/mg az U.V. abszorpció alapján számolt protein-becslésre számolva. 5. példa A példában glükóz izomeráz extraktumot különféle kvaterner ammonium vegyületekkel kezelünk. A 3. példában leírt izomeráz extraktumból egyenlő részeket veszünk, és a minták pH-ját pH=7 értékre állítjuk be, majd hozzájuk adjuk a különböző kvaterner ammonium vegyületeket 2000 ppm végső koncentráció eléréséig. Az enzim és a kvaterner vegyület közötti kölcsönhatás következtében csapadék képződik. A következő kvaterner ammonium vegyületeket vizsgáltuk: 1. BTC—835* C12—le alkil-dimetil-benzil ammónium-klorid 2. ARQUAD 18—50 Oktadecil-trimetil ammónium-klorid 20 3. CERTRIMIDE (CTAB) Cetil-trimetil ammónium-bromid 4. BTC-2125 M (DUAL QUAT) Cj2— is alkil-dimetil-benzil ammónium-klorid 25 CI2-i4 alkil-dimetil-(etil-benzil) ammónium-klorid 5. HYAMINE 1622 ( (p-Diizobutil-fenoxi) -etoxi-etil] -dimetil-benzil ammónium-klorid 30 6. HYAMINE 2389 (Metil-dodecil-benzil) trimetil ammónium-klorid Metil-dodecil-xilol-bisz (tetrametil) ammónium-klorid 35 7. MAQUAT DLC 1214 C,2-is alkil-dimetil (diklór-benzil) ammónium-klorid 8. BTC-812 Oktil-dodecil-dimetil ammónium-klorid 40 9. Hexadecil-trimetii ammónium-klorid Az 1., 4., 5. és 7. pont alatt felsorolt vegyületek esetén bőséges fehér csapadék képződik: kevesebb csapadék keletkezik a 8., 3. és 2. pont vegyü létéinél: míg a 9. és 6. pont 5 vegyü létéi esetén nem képződik csapadék. A szuszpenziókból centrifugálással elkülönítjük a csapadékokat és az elfolyó folyadékok alikvot mennyiségeit megvizsgáljuk izomeráz 50 aktivitás szempontjából. A csapadékokat 0,5 N sósavban újra szuszpendáljuk, ennek hatására az enzim-kvaterner ammonium vegyület komplex disszociál 55 és az enzim újra oldatba megy. 0,5 N sósav —0,2 MCo2+ oldattal való hígítás után megmérjük az oldatok izomeráz aktivitását. Az eredményeket a III. táblázatban foglaljuk össze. 7
