199512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sztroma mentes hemoglobin oldat előállítására
HU 199512 B 1 A találmány tárgya új eljárás sztroma mentes hemoglobinoldat előállítására hemolizált vörösvérsejteket tartalmazó oldatból oly módon, hogy az oldatot divinilbenzol-sztirol alapú nem poláros adszorpciós gyantával töltött kromatografáló oszlopon vezetjük keresztül 0°—24°C közötti hőmérsékleten. Az oxikológiai gyakorlatban a vérveszteséget rendszeresen pótolják. A modern terápiában lehetőleg nem a teljes vért, hanem annak azt a komponensét használják fel, amelyre a betegnek szüksége van. Azonban a vérkészítmények csak korlátozott mennyiségben állnak rendelkezésre, így a megfelelő komponens területi elosztása is komoly gondot okoz. A lejárati idő egyes készítmények esetén rendkívül rövid, ami tovább nehezíti az elosztást. A rövid lejárati idejű készítmények közül a vörösvérsejt koncentrátum talán a legjelentősebb, ennek lejárati ideje csupán 2l nap. A vörösvérsejt koncentrátum terápiás feladata az oxigéntranszportban való részvétel. Bár e készítményből általában nem mutatkozik hiány, az egyes vércsoportokat figyelembe véve már nem mondható egyértelműen kedvezőnek a helyzet. A fenti hátrányokon kívül a vörösvérsejt koncentrátum esetén hátrányt jelentenek a beadáskor mindig fellépő immunreakciók is, ezért nagy fontosságúak az oxigéntranszportot biztosító mesterséges vérpótlószerek kifejlesztésére vonatkozó kísérletek. E kísérletek közül ki kell emelni azt a megoldást, amely szerint a pótszer egy szintetikus készítmény lenne, amelynek semmiféle biológiai forráshoz nem lenne köze. Ezeknek a kísérleteknek a középpontjában bizonyos perfluoro-származékok vannak. Ezek a vegyületek lényegében oldószerek, amelyek fizikailag jól oldják az oxigént [Geyer, R.P., Jamieson, G.A., Greenwalt, T.J., Blood Substitutes and Plasma Expanders, Alan R. Liss, Inc., New York (1978), Naito, R., Yokohama K- Jamieson, G.A., Greenwalt, T.J. Blood Substitutes and Plasma Expanders, Alan, R. Liss Inc. New York (1978). A kísérletek ugyan biztatóak, de a megvalósításban még sok a gond: például a vegyületek kiválasztódnak a májban, stb. A pótszerként számbavehető készítmények lényegesen Ígéretesebb területének látszik a hemoglobint tartalmazó csoportja. Ebben az esetben a hemoglobin humán vörösvérsejtből származik. Előállítása során a hemoglobint ki kell szabadítani a sejtmembránból, majd meg kell tisztítani a sejtmembrán töredékétől. Az így készült hemoglobin oldatot a szakirodalomban „stroma-free", azaz sztroma mentes hemoglobinnak nevezik. A sztroma a sejtmembrán töredékek agglomerátumait jelenti. Maga a sztroma mentes hemoglobin oldat is egy lehetséges vérpótlószer [Gerald W. Peskin, Kevin O’Brien, S. Frederick Rabiner, Stroma-free hemoglobin solution: The ideal blood substitute?, Sur-2 2 gery, 66, 185—193 (1969)]. Azonban az egyszerű sztroma mentes hemoglobin oldat vérpótlószerként való alkalmazásának nagy hátránya az, hogy rendkívül gyorsan kiürül: a felfedezési idő 2—2,5 óra. A gyors kiürülést többféleképpen is próbálják hátráltatni, illetve megakadályozni. Kísérletek folynak a hemoglobin molekula módosításával, polimerizálásával, különböző anyagokból, így nylonból, poliaminosavból, polihemoglobinból készült kapszulába, illetve liposzomába való zárásával (Djordjevich, Lj., Miller, I.F. Exp. Hemat. 8, 584—592, 1980.) Az utóbbi kísérletek mindegyike sztroma mentes, tehát antigént nem tartalmazó hemoglobin oldatot igényel, vagyis olyan oldatot, amelyik nem vált ki immunreakciót. A vörösvérsejtből készült hemoglobin azonban megfosztva a természetes sejtmembrántól, antioxidáns és enzimrendszerétől, egy rendkívül gyors irreverzibilis oxidáció során az oxigéntranszportra alkalmatlan vegyületté, hemikrommá alakulhat és ez a folyamat adott esetben már a tisztítás közben megindul. Az átalakulás az 500—700 nm között felvett spektrummal könnyen és jól követhető. Látható, hogy a sztroma mentes hemoglobin oldat előállítása nem könnyen megoldható feladat. Ilyen hemoglobin oldat készítésének két alapvetően különböző útját reprezentálja a következő két megoldás. Az első [Gerald, W. Peskin, Kevin O’Brien, S. Frederick Rabiner, Surgery, 66, 185—193 (1969)] szerint a hemolizált vörösvérsejtet ultraszűrik, így elválasztják a nagyméretű membránpartikulumoktól. A módszer nagy hátránya, hogy a kisméretű membránrészecskéktől így nem lehet elválasztani a hemoglobint, s ezek jelenléte antigén tulajdonságokat okoz az oldatban. A másik megoldás [Khachaturjan, A.A., Vyazava, E.P., Morozova, G.M., Rosenberg, G.Ya, Probl. Hematol. 24, 58—60 (1979)] szerint a membránalkotókat szerves oldószerrel, például tetraklór-etilénnel extrahálják. Ez a lépés feleslegessé teszi a vörösvérsejtek előzetes lizálását. A tetra klór-etilént ezt követően paraffinolajjal extrahálják ki a hemoglobin oldatból. E módszer nagy hibája, hogy az oldószernyomokat nem lehet eltávolítani a hemoglobin oldatból. Az alkalmazható szerves oldószerek, s főként a tetraklór-etilén nagy toxicitása miatt ilyen módszerrel előállított készítmény véleményünk szerint semmiképpen nem használható humán célra. Célkitűzésünk volt tehát olyan egyszerűen kivitelezhető eljárás kidolgozása, amely alkalmas egyszerű laboratóriumi körülmények között sztroma mentes hemoglobin oldat előállítására és amely eljárás mentes az előzőekben ismertetett eljárások hátrányától. Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
