199512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sztroma mentes hemoglobin oldat előállítására
HU 199512 B 3 amennyiben divinilbenzol-stirol alapanyagú nem poláros adszorpciós gyantával töltött kromatografáló oszlopon vezetjük át a hemolizátumot, akkor a hemoglobin csak kis részben kötődik meg, míg a membránpartikulumok teljes mennyisége az oszlopon marad. Eljárásunk rendkívül egyszerűen kivitelezhető és tökéletesen kiküszöböli az előzőekben ismertetett eljárások hátrányait, mert a kapott oldatban membrántöredék egyáltalán nincs jelen, tehát az oldat nem mutat antigén tulajdonságokat, másrészt semmilyen toxikus vegyületet nem alkalmazunk az eljárás során, így annak maradványaival sem kell számolni. Kísérleteket végeztünk különböző gyártóktól származó, de azonos típusú adszorpciós gyantákkal és azt tapasztaltuk, hogy mindegyik divinilbenzol-stirol alapú nem poláros gyanta alkalmas a hemolizátum sztromamentesítésére. Adszorpciós gyantaként például Amberlite-XAD 2, Amberlite-XAD-4, Diaion HP-20, SP-207, SP-800 gyantákat használhatunk. A kísérleteket elvégeztük a gyanta és a hemolizátum egyszerű összekeverésével is, így azonban nem értünk el megfelelő eredményt: a kielégítő tisztítást csak adszorpciós oszlopon való átcsurgatással tudtuk elérni. Megállapítottuk, hogy a különböző adszorpciós gyanták egymástól eltérő sebességgel kötik meg a membránpartikulumokat, mindegyikre jellemző viszont, hogy jó eredmény csak lassú kromatografálási áramlási sebesség mellett érhető el. Találmányunk szerint úgy járunk el, hogy valamilyen vörösvérsejteket tartalmazó oldatot, például vért, előnyösen vörösvérsejt koncentrátumot (amely kereskedelmi forgalomban lévő vérkészítmény) tetszőleges ismert módon hemolizálunk, ezt követően a hemolizátumot divinilbenzol-stirol alapú nem poláros adszorpciós gyantával töltött kromatografáló oszlopon vezetjük keresztül 0°— 24°C közötti hőmérsékleten, előnyösen szobahőmérsékleten. Az így nyert sztroma mentes hemoglobin oldatot felhasználásig hűtőszekrényben tároljuk. A kromatografálási a hemolizátum térfogatára számítva 1—3-szoros térfogatú oszloptöltettel, kis, legfeljebb 60* 10-6 nr/s áramlási sebességgel végezzük, a b/d hányados (oszlophossz/átmérő) > 8. A találmány szerinti eljárással előállított sztroma mentes oldat sztromamentességét fáziskontraszt és elektronmikroszkópos technikával, a ' hemoglobinnak és esetleges bomlástermékeinek jelenlétét pedig a látha-4 tó spektrum 500—700 nm-es tartományában spektroszkópiásan ellenőrizzük. Találmányunkat az alábbi példák szemléltetik anélkül, hogy igényünket ezekre a 5 példákra korlátoznánk. 1. i .Ida 500 ml humán vörösvérsejt koncentrátumot háromszor 200 ml fiziológiás' sóoldat- 10 tál mossuk. A mosófolyadékot 20—20 perces centrifugálással (2000 g) választjuk el a mosandó sejtektől. A műveletet -f-4°C-on végezzük. Az utolsó mosás után a sűrítményt desztillált vízzel 100 ml-re kiegészítjük, majd 15 az oldatot öt alkalommal —18°-C-os hűtőszekrényben lefagyasztjuk, illetve szobahőmérsékleten felengedni hagyjuk. E művelet során gyakorlatilag az egész vörösvérsejttömeg hemolizálódik. A hemolizátumot 200 ml 20 DIAION SP-207 adszorpciós gyantát tartalmazó 2,5 cm átmérőjű kromatografáló oszlopon engedjük keresztül 60-10~6 m3/s áramlási sebességgel. A hemoglobinra jellemző piros szín megjelenése után 20 ml-es frak- 25 ciókat gyűjtünk. Az 1—6. frakció tartalmazza a kiindulási hemoglobin mennyiség 70% - át. A kapott termék elektromikroszkóposan, illetve fáziskontraszt mikroszkóppal vizsgálva sztroma mentes, spektrális képe megegye- 30 zik a teljes vér spektrumával. 2. példa Mindenben az első példában leírtak szerint járunk el, azonban adszorpciós gyanta- 35 ként DIAION HP-20 gyantát használunk. A nyert termék az 1. példában leírt módon vizsgálva sztromamentes. 3. példa 40 Mindenben az első példában leírtak szerint járunk el, azonban adszorpciós gyantaként DIAION SP-800 gyantát használunk. A kapott termék az 1. példában leírt módon vizsgálva sztromamentes. 45 SZABADALMI IGÉNYPONT Eljárás sztroma mentes hemoglobin oldat előállítására hemolizált vörösvérsejteket g0 tartalmazó oldatból, azzal jellemezve, hogy az oldatot divinilbenzol-sztirol alapú nem poláros adszorpciós gyantával töltött, a hemolizátum térfogatára számítva 1—3-szoros térfogatú oszloptöltettel rendelkező, 8-nál 55 nagyobb oszlophosszúság/átmérő hányadosú kromatografáló oszlopon vezetjük keresztül legfeljebb 60* 10—6 nr/s áramlási sebességgel, 0°—24°C közötti hőmérsékleten. Rajz nélkül Kiadja: Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Himer Zoltán osztályvezető N* 1125. Nyomdaipari vállalat, Ungvár
