199494. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új szacharidok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
7 HU 199494 B 8 centrációval 48 órán át RPMI táptalajban inkubáljuk, és a sejt-felüluszókat elkülönítjük. Ezeket 1L-1 aktivitásra megvizsgáljuk C3H/Hej egerek timocita tenyészeteiben. A makrofágok által termelt IL-l-et tartalmazó felüluszók timocitái 72 órás inkubálás alatt szaporodni kezdenek. A szaporodást 3H-timidin beépítésével mérjük, szcintillációs számlálóban [J.Gery és munkatársai: J.Exp.Med. 136, 128—142 (1972); J.Oppenheim és munkatársai: Callular Immunoi. 50, 71—81 (1980)). Az (I) általános képletű vegyületek különböző arányokban (0,1—50 pg/ml koncentrációkban) képesek inkubálni IL-1 termelést makrofágokban. 9. LPS (endotoxin) tolerancia (halálozási tolerancia) indukció Az úgynevezett tolerancia indukálható egerekben, LPS-ot 1—3-szor naponta parenterálisan beadva. Ez a tolerancia megvédi az állatokat a galaktózamin beadását követően beadott LPS halálos hatásai ellen (endotoxin-sokk előidézését egerekben lásd fent). Az (I) általános képletű vegyületek azt a tolerenciát már egyetlen, 025 mg/egér i.p. dózis beadása után előidézik. Előkezelt (toleráns) egerek LPS kiváltó dózist kapnak, 0. 01 pg LPS+8 mg galaktózamin/egér menynyiségben, i.p., különböző időintervallumokban (1 nap — 3 hét) az utolsó kezelést követően. Az állatok nagyobb hányada túléli az LPS kiváltó dózist, főképpen három alkalommal ismételt beadás után, mint az előre nem kezelt, kiváltó dózist kapott kontrollok. Az (I) általános képletű vegyületek gyulladásgátló hatásúak is, elsősorban nem-specifikus, immunológiásan indukált és magas vérnyomás által előidézett gyulladásoknál és allergiás reakcióknál. Ez a hatásuk különböző kísérleti eljárásokkal bizonyítható, például vizsgálva hatásukat a prosztaglandin szintézisre in vitro és in vivo. In vitro vizsgáljuk az LPS- és zymosan-indukált PGE2- és PGFI(í-felszabadulás gátlását. NMRI egerekből származó, tioglikoláttal stimulált peritoneális leukocitákat LPS-dal vagy egy kísérleti anyaggal 24 órán át inkubátunk. Táptalajt változtatva és a sejteket háromszor mosva, ezeket 2 órán át LPS-dal, illetve 1 órán át zymosannal stimuláljuk. Ezekben a felüluszókban a PGF2-t és a PGF,a-t meghatározzuk. Azt találjuk, hogy az LPS-dal, illetve a zymosannal stimulált sejtek a PGE2-termelést gátolják. In vivo a kísérleti anyagokkal előkezelt egerek peritoneális leukocitáinak gátló hatását mérjük az LPS-indukálta PGE2-felszabadulásra. Három NMRI egerekből álló csoportokat az 1., 2. és 3. napon LPS-dal, illetve a kísérleti anyaggal kezelünk i.p. A 4. napon ezek az állatok és a kontrollcsoport egerei 1. p. 1,5 ml tioglikolátot kapnak, a 7. napon az egerek peritoneális leukocitáit elkülönítjük és LPS-dal stimuláljuk. A kontroliokkal összehasonlítva a PGE2-felszabadulás jelentős csökkenése figyelhető meg. Egy következő kísérletben mérjük a prokoagulánsaktivitásra (PCA) gyakorolt hatást. LPS-dal végzett stimulálás után a humán endoteliális sejtek PCA-t szintetizálnak, amint ez a plazma rövidebb alvadási idejéből megállapítható. Egerek peritoneális leukocitái LPS-kezelés után és nyulakból izolált peritoneális leukociták a generalizált Shwartzman-reakció kiváltása után rekalcifikált plazma alvadási idejét ugyancsak megrövidíti. In vitro, az LPS által indukált PCA-ra gyakorolt hatál vizsgálatához tioglikoláttal stimulált B6D2F, egerek peritoneális leukocitáit éjszakán át LPS-dal egyedül, illetve LPS-dal és a kísérleti anyaggal kezeljük magzati borjuszérumtól (FCS) mentes DMEM táptalajban (a) kísérlet. Egy másik b) kísérletben egerek peritoneális leukocitáit 24 órán át LPS-dal, illetve a kísérleti anyaggal kezeljük, és a táptalaj megváltoztatása után éjszakán át LPS-dal stimuláljuk. Mérjük a rekalcifikált humán kontroll plazma koagulációs idejét a Hackchen-eljárássai, az egér peritoneális leukocita-szuszpenziójának hozzáadása után, amit előzetesen ismételten kifagyasztottunk és ultrahanggal kezeltünk. A kísérleti anyag hozzáadása az LPS által kiváltott PCA-t, a kontroliokkal összehasonlítva csökkentette (az alvadási idő növekedett). A kísérleti anyaggal való előkezelés hasonlóan csökkenti a PCA-t. In vivo, egerek peritoneális leukocitáinak LPS-indukálta PCA-ra gyakorolt hatást a kísérleti anyaggal való előkezelés után a következőképpen vizsgáljuk: B6D2F, egereket az 1., 2. és 3. napon i.p. kezelünk LPS-dal, illetve a kísérleti anyaggal. Valamennyi állat a 3. napon kap még 1,5 ml tioglikolátot i.p. A 6. napon a peritoneális leukocitákat elkülönítjük, valamennyi állatból vett mintát 1X106 sejt/ml koncentrációra beállítjuk, és 24 órán x magzati borjuszérumtól mentes DMEM táptalajban LPS- dal stimuláljuk. A sejtek PCA termelését a fentiek szerint meghatározzuk. LPS-dal, illetve a kísérleti anyaggal végzett előkezelésnél a PCA jelentősen csökken. Ugyanerre a megállapításra jutunk nyulaknál is. A nyúl peritoneális leukocitái által termelt PCA a szokásos Shwartzmann-reakció kiváltása után csökken, ha az állatokat LPS-dal, illetve a kísérleti anyaggal előkezeljük. A lokális Shwartzmann-reakció gátlására három csincsillanyulat előkezelünk i.v., illetve i.p., LPS-dal, illetve a kísérleti anyaggal, az 1., 2. és 3. napon. A 6. napon az állatoknak LPS/kg i.v. beadásával kiváltjuk. A kiértékelést félig kvantitative végezzük, vizsgálva a bőrelhalást. Azt találtuk, hogy LPS-dal, illetve a kísérleti anyaggal előkezelve, az állatoknál a Shwartzmann-reakció csaknem tökéletesen megállapítható. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
