199494. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új szacharidok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 199494 B 6 válás mértékét, a citokróm-C redukciójának szuperoxid-diszmutáz által történő gátlása formájában. 10-6 mól formil-metionil-leucil-fenilalanint tartalmazó 80, pmól citokróm-C-hez IX106, a kísérleti vegyülettel előkezelt vagy kezeletlen neutrofilt adunk. A kontrollok még 50 pg szuperoxid-diszmutázt is tartalmaznak. A reakciókeveréket 15 percig 37°C- on inkubáljuk, majd a kémcsövet jégfürdőbe helyezve a reakciót leállítjuk. Ezután a kémcsöveket a sejtek elválasztása céljából 15 percig centrifugáljuk (400 g). A citokróm-C redukcióját, amely a felszabadult szuperoxid-anion mennyiségével arányos, 550 nm-en fotometriásan mérjük. A kísérleti vegyület inhibitorhatását az LPS-nak a PMN-re (PMN=poIimorfonukleáris neutrofil leukocita) gyakorolt aktivitására a fenti módon mérjük, emellett a leukociták előinkubálása után a sejteket tovább inkubáljuk az LPS egy stimuláló koncentrációjával. 5. Szén klirensz teszt Ez a kísérlet azon az elven alapszik, hogy a 20,0—25,0 nm méretű részecskék (például szénszemcsék) a szervezetből csak makrofágok által végzett fagocitózissal távolíthatók cl. Szénszemcséket intravénásán beadva, ezeket a véráramból a makrofágok a májban (Kupffer sejt) és a lépben fagocitózissal távolítják el. Egy anyag RES-aktiválásának (RES=retikuloendoteliális rendszer) a meghatározását egyszeri vagy ismételt beadással, vizes oldatban vagy szuszpenzióban végezzük. Egy anyagnak a kezeléshez előre megállapított mennyiségét i.p. vagy s.c. adjuk be napi négy dózisban vagy egyszerre, 24 órával a kísérlet megkezdése előtt. 10% gázkorom tartalmú szuszpenziót 1%-os zselatinos nátrium-kiorid-oldattal 16 mg szén/ml koncentrációra hígítunk. Mindegyik egér 0,2 ml/20 g testtömeg szuszpenziót kap i.v. Az i.v. beadás után 3,6,9, 12 és 15 perccel az orbitális plexusból punkcióval 25 pl vért veszünk. A vért 2 ml desztillált vízben hemolizáljuk. A széntartalmú fotometriásan meghatározzuk. Az állatokat ezután leöljük és májuk és lépük súlyát megmérjük. 6. Herpeszfertőzés (egérben) Az intrakután herpeszfertőzés lehetővé teszi, hogy megállapítsuk a herpeszvirusokkal megfertőzött egereknél az immunválasz növekedésének fokát. A betegség lefolyása elhúzódó és lehetővé teszi, hogy megfigyeljük több paraméter egymást követő megjelenését. Herpeszes léziók jelentkeznek a fertőzés helyén, amelyek elfekélyesednek, a közelebb lévő láb megbénul és a bénulás fokozódik, végül halált okozva. Immunkompetens „csupasz" (szőrtelen) egereket a 0. napon intrakután megfertőzük, a kísérleti inokulumot 0,025 ml térfogatban (például a Herpes-simplex 1 típus IX16® plakképző egységét/egér) beadva. A kísérleti vegyületet oldva adjuk be i.p., például 0,1 ml fiziológiás só5 oldatban. A szisztémás herpeszfertőzés tehát azt is lehetővé teszi, hogy meghatározzuk herpeszvirusokkal megfertőzött egereknél az immunválasz növekedésének fokát. Az immunkompetens NMRI egereket a 0. napon megfertőzünk, a kísérleti inokulumot 0,1 ml térfogatban i.p. beadva (például a Herpes-simplex 1 típus 1.3X105 plakképző egységét/egér). A kísérleti vegyületet oldatban.éldául fiziológiás sóoldatban s.c. adjuk be. A kísérleti állatokat a fertőzés utáni 20. napig megfigyeljük, a léziók és bénulás megjelenését és a halál beálltát feljegyezzük. Mérjük az alábbi paramétereket, és ezeket a fertőzés kontrolljának vagy egy standardnak az adataival összehasonlíjuk: a) az egerek száma, amelyeknél lézió lépett fel (kumulálódó); b) az egerek száma, amelyeknél bénulás lépett fel (kumulálódó); c) átlagos túlélési idő; d) túlélési arány. Az (I) általános képletű vegyületekkel kapott értékek a betegség lefolyását, a túlélési időt és a túlélési arányt tekintve, lényegesen jobbak, mint a kezeletlen kontrolloknál kapott értékek, a kísérleti Herpes-simplex virus-1 fertőzés napját alapul véve a 0. vagy —1. és a -(-6- napok között, egyetlen i.p., illetve s.c. dózis beadása után. 7. CSF (colony stimulating faktor) indukció A CSF-ok mediátorok, amelyek fertőzéseket vagy toxinhatásokat követően a szervezetben képződnek. Biológiai hatásuk komplex, ezt a vérképző rendszer, elsősorban a csontelősejtek szaporodásának a stimulálásával mutatjuk ki. B6D2F, egereknek beadjuk a kísérleti vegyületeket, egyszer vagy ismételten, parenterálisan vagy orálisan, legfeljebb 50 mg/kg dózisban. Egymás után különböző időintervallumokban a kísérleti állatokból szérumot veszünk le. A szérum CSF-aktivitásának titerét sejttenyésztéses vizsgálattal, a B6D2F, egerek csontvelősejt-szaporodásának a sebességével mérjük. [D. Metcalf: The Hemopoietic Colony Stimulating Factors, 1984, Elsevier; T. Mosmann; J. Immunol. Methods, 65, 55—63 (1983); L.M.Green és munkatársai: J.Immunol.Methods, 70, 257—268 (1984)]. Az (I) általános képletű vegyületek különböző mértékben indukálják egérben a CSF- okat, így a CSF-aktivitásoknál mutatkozó idő-kinetikai különbségeket is megfigyeljük, s ez a terápiás alkalmazásnál hasznos lehet. 8. Interleukin-1 (IL-1) indukció Annak meghatározását, hogy egy anyag stimulálja-e a sejteket TL-1 termelésre, elsősorban sejttenyésztéses vizsgálattal végezzük. Először egerek adherens makrofágjait izoláljuk, mint a rezidens makrofágokat, mind a tioglikoláttal eltávolított makrofágokat. Ezeket a kísérleti vegyületek'et különböző kon5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
