199494. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új szacharidok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
3 HU 199494 B 4 A reakcióvázlaton TBDMS = terc-butil-dimetil-sziiilcsoport. A (IV) általános képletű vegyületeket a [B], [C] és [D] reakcióvázlatok szerint állítjuk elő, amelyeknél a szemléltetett reakcióban részt nem vevő hidroxilcsoportok megfelelő védett formában lehetnek. A reakcióvázlatokon szereplő ‘szubsztituensek a következő jelentésüek: R, R’ védőcsoportok, R5 egymástól függetlenül mindegyik azonos jelentésű, mint R,, R2, R3 és R«. Ac acetilcsoport, TBDMS terc-butil-dimetil-szililcsoport. A (IVa) általános képletű vegyületeket a [B] reakcióvázlat szerint, a (IVb) általános képletű vegyületeket a [C] reakcióvázlat szerint és a (IVc) általános képletű vegyületeket a [D] reakcióvázlat szerint állítjuk elő. Amennyiben valamely speciális kiindulási anyag előállítását nem írjuk le egyedileg, úgy az ismert vegyület vagy a szokásos módon vagy a példákban leírtakhoz hasonló eljárásokkal előállítható. Az (I) általános képletű vegyületek farmakológiái hatásokkal rendelkeznek, s így mint gyógyszerek alkalmazhatók. A fenti vegyületek előnyös hatással vannak a nem-specifikus mikróbaellenes rezisztenciára. Ezt a hatást az alábbi kísérletek szemléltetik. 1. Endotoxinos aktivitás meghatározása limulus amőbocita-lizátum tesztben Az endotoxin katalizálja egy proenzim aktiválását limulus-amőbocita lizátumban. A p-nitro-anilin lehasadását mérjük egy színtelen szubsztrátumból.. Ennek a lehasadásnak a mértékét fotometriásan állapítjuk meg. Az összefüggés az abszorpció és az endotoxin-koncentráció (illetve analógiásán az endotoxin-aktivítás) között 0,01—0,1 ng/ml endotoxin tartományban lineáris (egy standard endotoxin abszorpció értékeivel összehasonlítva). A pirogén anyagoktól mentes steril, kétszer desztillált vízben feloldott mindegyik mintából 1:10 higítási sorozatot készítünk és készítünk egy vakpróbát. 100 pl kísérleti mintát vagy referencia standard mintát vagy vakpróbát reagáltatunk 100 pl limulus-amőbocita lizátummal. A reakciókeveréket 10 percig 37°C-on inkubáljuk, majd 200 pl szubsztrátummal reagáltatjuk, további 3 percig inkubáljuk, és a .reakciót 200 pl 50%-os ecetsavval leállítjuk. A mintát megkeverjük és az abszorpciót spektrofotométer 405 nm-en mérjük, levonva belőle a háttérértéket. A minta endotoxin-tartalmát (az endotoxin aktivitását) lineáris regressziós analízissel számítjuk ki, a standard endotoxin értékeivel. 2. Endotoxin-sokk előidézése egérben A kísérlet abból áll, hogy endotoxin sokkot vagy más, halált okozó hasonló klinikai állapotot idézünk elő LPS-analóg anyagokkal (LPS=lipopoliszacharid), galaktózaminnal (GalN) szenzibilizált egerekben. Csoportonként 6 darab, hím C57 bl egérnek i.p. beadunk egyidejűleg 8 mg galaktózamint 0,5 ml foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) oldva és Salmonella abortus equi-ből (SIGMA) származó 0,1 pg lipopoliszacharidot (LPS) 0,2 ml fiziológiás sóoldatban oldva. Ez a kezelés 6—12 órán belül valamennyi állatott megöli. [C.Galanos és munkatársai: Proc.Natl.Acad.Sci., USA 76, 5939—5943 (1979)]. A standard kezelésben az LPS helyett a kísérleti anyagokat adjuk be egyszer, különböző dózisokban, egyidejűleg a galaktózaminnal; vagy pedig parenterálisan vagy orálisan a galaktózaminnal végzett kezelés előtt vagy után. Az eredményeket úgy értékeljük ki, hogy összehasonlítjuk a legkisebb dózisokat, amelyek egy csoport valamennyi állatára halálosak; vagy az LDS0-értékeket Spearman-Karber módszerével számítjuk ki. 3. Mikróbás szeptikémia neutropéniás egerekben Ez a modell lehetővé teszi az immunválasz anyagfüggő növekedésének a meghatározását mikróbásan fertőzött neutropéniás egerekben. Neutropénia előidézésére 20 darab nőstény B6D2F,-egérből álló csoportoknak beadunk egyszer s.c. 200 mg/kg testtömeg ciklofoszfamidot 0,2 ml desztillált vízben feloldva a 0. napon. A harmadik napon a kísérleti anyagot beadjuk parenterálisan, elsősorban i.p. vagy orálisan, amennyiben lehetséges fiziológiás nátrium-klorid-oldatban oldva vagy más módon feloldva (0,3 ml). A fertőzés a 4. napon történik, a szóbanforgó inokulum i.v. beadásával 0,2 ml térfogatban (csíraszám például: Pseudomonas aeruginosa/egér A12:1X102 * * 5; E.coli A120:2X106; Staph, aureus Al 13:1X106; Candida albicans A124: :1X104). A kísérleti állatokat a fertőzést követő 10. napig megfigyeljük, és elpusztulásukat naponta feljegyezzük. A kontroll vagy standard egerek fertőzésével kapcsolatban a következő paramétereket számítjuk ki: a) átlagos túlélési idő, b) túlélési arágy. Az (I) általános képletű vegyületekkel kezelt állatok jelentősen jobb túlélési időket és túlélési arányokat mutatnak, mint a kezeletlen kontrollok, Gram-negativ baktériumokkal (például Pseudomonas és E.coli) végzett kísérleti fertőzéseknél, valamint Gram-pozitiv baktériumokkal (például Staph.aureus) vagy élesztőkkel (például Candida albicans) végzett fertőzéseknél parenterálisan beadás után. 4. Humán vér-neutrofil oxidációs metabolizmusának aktiválása Legalább 95% tisztaságú neutrofileket egy találmány szerinti vegyülettel három különböző koncentrációban 1—2 órán át 37°C-on inkubálunk. Ezután mérjük a sejtekből felszabaduló szuperoxid-anionokat, mint az akti3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
