199471. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kondenzált diazepinonok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 199471 B a könny-, nyál- és gyomorsav-elválasztásra gyakorolt hatás viszonya. Az alábbi kísérletek bizonyítják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek e tekintetben meglepően előnyös tulajdonságnak. A) A muszkarin receptorokhoz való kötődés vizsgálata Az IC50-érték meghatározása in vitro A szerveket 180—220 g testtömegű, hím Sprague-Dawley patkányokból izoláltuk. A szív, az állkapocs alatti szövetek, valamint az agykéreg kivétele után azokkal minden további műveletet jéghideg Hepes-sósav-pufferelegyben végeztünk. A szívet egészben vettük ki, és ollóval daraboltuk fel, majd mint a többi szervet is, Potter-féle berendezésben homogenizáltuk. A receptorkötődési vizsgálathoz a szervhomogenizátumokat az alábbi arányban hígítottuk: Szív 1:400 Agykéreg 1:3000 Állkapocs alatti szövetek 1:400 A szervhomogenizátumokat ezt követően a radioaktív ligandum meghatározott menynyiségével és a nem radioaktív vizsgálati anyag hígítási sort képező mennyiségeivel, Eppendorf centrifugacsövekben, 30°C hőméksékleten, 45 percig inkubáltuk. Radioaktív ligandumként [3H]-N-metil-szkopolamint (3H-NMS) alkalmaztunk. Az inkubációs idő lejártával jéghideg pufferoldatot adtunk a mintákhoz, majd szívatással megszűrtük azokat. A szűrőt hideg pufíeroldattal átöblítettük és meghatároztuk a radioaktivitását. Az így kapott érték az összes, specifikusan és nem specifikusan kötött 3H-NMS mennyiségét mutatja. A nem specifikus kötődés mértéke az 1 pM kinuklidin-benzoát jelenlétében megkötött radioaktivitásból adódik. Minden esetben több párhuzamos mérést végeztünk. A nem radioaktív anyag IC50-értékét grafikusan határoztuk meg. Az IC50-érték a vizsgálati anyagnak az a koncentrációja, amely a 3H-NMS specifikus kötődését a különböző szervekből nyert muszkarin receptorokhoz 50%-ban gátolja. Az eredmények az 1. táblázatban láthatók. B) A muszkarin antagonista hatás funkcionális szelektivitásának vizsgálata A muszkarin antagonista tulajdonságú hatóanyagok gátolják a külső eredetű ago nisták, valamint a kolinerg idegvégződéseken felszabaduló acetil-kolin hatását. Az alábbiakban ismertetjük azokat a módszereket, amelyekkel — mások nyomán — a kardioszelektív muszkarin antagonista hatást behatárolható. In vivo módszerek A vizsgálatok célja az volt, hogy igazoljuk a muszkarin antagonista hatás szelektivitását. Minden hatóanyaggal, amelyek az in vitro tesztek alapján kiválasztottunk, elvégeztük az alábbi vizsgálatokat: 1. M,/M2-szelektivitás patkányokon. 9 6 2. Nyálelválasztást gátló hatás patkányokon. 3. Az acetil-kolin hólyagra, hörgőkre és a szívfrekvenciára gyakorolt hatásának gátlása tengerimalacokon. 1. M,/M2-szelektivitás vizsgálata patkányokon A módszert Hammer a Giachetti (Life Sciences, 31: 2991—2998 /1982/) írták le. A kísérletekhez hím THOM patkányokat használtunk. A vizsgálati anyag növekvő dózisainak intravénás befecskendezését követően, 5 perc múlva, vagy a jobb oldali bolygóideget ingereltük elektromosan (frekvencia: 25 Hz; impulzusszélesség: 2 ms; időtartam: 30 s; feszültség: szupramaximális), vagy 0,3 mg/kg dózisban, intravénásán McN-A-343-at [ [4- [ (3-klór-fenil) -karbamoil-oxi] -2- -butinil] -trimetil-ammónium-klorid] adtunk az állatoknak, és meghatároztuk egyrészt a bolygóidegi ingerléssel kiváltott bradikardia, másrészt az McN-A-343 okozta vérnyomás-növekedés mértékét. A hatóanyagnak azt a dózisát, amely a bolygóidegi bradikardiát (M2)} illetve a vérnyomás növekedését (M,) 50%-ban gátolta, grafikusan határoztuk meg. Az eredmények a 2. táblázatban találhatók. 2. Nyálelválasztást gátló hatás vizsgálata patkányokon A vizsgálatot Lavy és Mulder szerint /Archint. pharmacodyn., 178: 437—445 (1969)/, 1,2 g/kg uretánnal altatott, hím THOM patkányokon végeztük, amelyeket a vizsgálati anyag növekvő dózisaival intravénásán kezeltünk. A nyálfolyást 2 mg/kg pilokarpin szubkután beadásával váltottuk ki. A, nyálat szűrőpapírral itattuk fel, és a kapott folt méretét 5 percenként planiméterrel meghatároztuk. A hatóanyag dózisát, amely a nyál mennyiségét 50%-kai csökkentette, grafikusan állapítottuk meg. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaltuk össze. 3. Az acetil-kolin hólyagra, hörgőkre és a szívfrekvenciára gyakorolt hatásának gátlása tengerimalacokon Altatott tengerimalacokat 5 perccel a vizsgálati anyag beadását követően 10 pg/kg acetil-kolinnal kezeltünk egyidejűleg intravénásán, illetve intraartériásan. A szívfrekvenciát a bőrfelületről történt elvezetéssel elektrokardiográfiásan, a légzési ellenállást Konzett-Rössler szerint, a szabaddá tett hólyag kontrakcióját pedig közvetlenül mértük. Az acetil-kolin hatásának gátlását a vizsgált szervekre vonatkozólag dózis-hatás-görbén ábrázoltuk, és abból határoztuk meg a -log ED50- •értékeket. Az eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be. A felsorolt vizsgálatokat például az alábbi vegy Öletekkel: A = 4,9-dihidro-3-metil-4-[ [4-(3-piperidino-propil ) -piperidin-1 -il] -acetil- 10H-tieno[3,4-b] f4,5]benzodiazepin-6-on; 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
