199461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oktahidro-indolizin és -pirido(1,2-a)pirimidin-propánsav-származékok előállítására
HU 199461 B tonitril/hangyasav/víz (2,5:0,3:97,2 térf.%) eleggyel eluáljuk. Az A-faktort tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepáriás után koncentráljuk. A HPLC oszlopról lejövő, koncentrált A-faktort anioncserélő gyantán, mint 100— 200 mesh szemcseméretű BioRex 5 (Cl-) gyantán (BioRad Laboratories, Richmond, CA) kromatografáljuk. Az oszlopot mintegy 0,2M—0,5M NaCl-dal eluáljuk és a tiszta A-faktort tartalmazó frakciókat egyesítjük. Az egyesített frakciókat mintegy pH 2,2— 2,5-ig megsavanyítjuk például In sósavoldattal, majd Diaion HP-20 gyantán bocsátjuk át az anioncserélő kromatográfia frakcióiban jelenlévő sók eltávolítása céljából. A HP-20 gyantát 0,01n sósavoldattal állítjuk elő a felhasználás előtt. Az A-faktor eluálása céljából az oszlopot először híg savval (pH 2,3), majd vízzel és végül vizes acetonitrillel (15:85 térf.%) mossuk. Az A-faktort tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepárlással koncentráljuk, és a koncentrátumot liofilizálva tiszta A-faktort kapunk amorf fehér por alakjában. A B- és C-faktort tartalmazó, egyesített frakciókat — melyekhez a fent leírtak szerint a tisztított tápfolyadék HP-20 oszlopon végzett gradiens elúciója során jutottunk — kisebb térfogatra pároljuk be. A koncentrált B- és C-faktort ' ezután polisztirol-poliszulfonsav gyantán, mint Dowex 50W (H-^) (Dow Chemical Co.) kromatografáljuk. A gyantáról a B- és C-faktort ionmentesített vízzel mossuk le. A, B-faktort tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepároljuk. A C-faktort tartalmazó frakciókat ugyancsak egyesítjük és bepároljuk. A koncentrált B- és C-faktort külön-külön tisztítjuk fordított fázisú HPLC-vel, C,8- -szilikagélt, például oktadecil—szilánozott Whatman LP-1 szilikagélt használva. A B-faktor eluálásához először hangyasav/víz (0,3: :99,7 térf.%) elegyet, majd acetonitril/hangyasav/víz (6,0:0,3:93,7 térf.%) elegyet és végül acetonitril/hangyasav/víz (15,0:0,3: :84,7 térf.%) elegyet használunk. A C-faktor hasonló oldószerrendszerrel eluálható, amely azonban magasabb koncentrációban 11 tartalmaz acetonitrilt. Az aktív frakciókat egyesítjük és koncentráljuk. A koncentrált B- és C-faktor tovább tisztítható az A-faktorra fentebb leírt eljárással. 5 Például mindkét koncentrátumot anioncserélő gyantán kromatografáljuk, a megfelelő eluátumokat megsavanyítjuk, nemfunkciós gyantán sómentesítjük és a sómentes eluátumokat liofilizáljuk. 10 Az A-faktor bőségesebben képződik a fiés a C-faktornál, és a találmány előnyben részesített ACE-inhibitora. A B-faktor viszont nagyobb mennyiségben képződik, mint a C-faktor. 15 A találmány hatókörét nem korlátozó, alábbi példák a találmány további ismertetésére szolgálnak. 1. példa 20 A58365 A-faktor katalitikus hidrogénezése 600 mg A58365 A-faktort 40 ml jégecetben oldunk, 600 mg Pt20 katalizátort adunk hozzá és a szuszpenziót szobahőmérsékleten, 4,137.10s Pa hidrogénnyomás alatt 24 órá- 25 ig hidrogénezzük. A katalizátort szűréssel elválasztjuk a redukciós keveréktől. A szűrletet liofilizálva 583 mg redukált termékkeveréket kapunk. A keveréket egyedi redukált termékekre 30 fordított fázisú HPLC-vel választjuk szét a következőképpen. 2,54 cm belső átmérőjű és 30,5 cm hosszú Zorbax ODS (Dupont) oszlopot (Cl8 kötött fázis, 12 p, részecskeméret) használunk. A következő gradienst alkalmaz- 35 zuk: Oldószer Térfogat% Térfogat (ml) A: ecetsav/víz 0,2:99,8 120 B: acetonitril/ ecetsav/víz 8:0,2:91,8 2040 40 C: acetonitril/víz 50:50 220 A redukált termékkeveréket (583 mg) 3 ml A mozgó fázisban oldjuk és az oszlopba injektáljuk. Az áramlási sebesség a kromatográfia alatt 10 ml/min és számos 20 ml-es frakciót gyűjtünk. A frakciókat analitikai 45 HPLC-vel detektáljuk 210 és 254 nm hullámhosszon. Az azonos termékeket tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk és liofilizáljuk, az alábbiak szerint. 12 Egyesített frakciók Termék Tömeg /mg/ 17-22. A-faktor, redukálatlan 133,6 27-31. Dekarboxi-A 10,8 36-41. Dezoxi-A 40 58-86. Tetrahidrodezoxi-A 182 /túlsúlyban levő izomer/ 87-96. Dezoxidekarboxi-A 5,5 A többi összegyűjtött frakciót egyesítjük, bepároljuk és azonos oszlopot használva újrakromatografáljuk. A mozgó fázis körülbelül 140 ml 0,2% vizes hangyasav, majd 10% acetonitril 0,2%-os vizes hangyasavban. Az 65 átfolyási sebesség 10 ml/min és 20 ml-es 7
