199461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oktahidro-indolizin és -pirido(1,2-a)pirimidin-propánsav-származékok előállítására
1 1 JCJ1U1 U lünk; a szokványos habzásgátlók bármelyike alkalmazható a fermentálásánál, így például szilikon habzásgátlók. A fermentáció folyamán az ACE-gátlók képződését HPLC-vel követjük, a fermentléből időnként mintát véve. A legnagyobb termelés általában 70—90 órás fermentációnál következik be. A HPLC próbához álló fázisként 4 mmX300 mm méretű p Bondapak C,8 oszlopot (Waters Associates), és mozgó fázisként acetonitril/hangyasav/viz rendszert (6:0,3:93,7 térfogat%) használunk. Az áramlási sebesség 2,5 mí/min. A faktorokat Schoeffel Model FS970 spektrofluorométerrel detektáljuk X,„c.=327 nm hullámhosszon, 370 nm zárószűrőt alkalmazva. A fermentálás végrehajtásakor kis térfogatú vegetatív táptalajt az S. chromofuscus NRRL 15098 liofilizált pelletjével. A tenyészetet körülbelül 30°C-on inkubáljuk, és a megfelelő növekedés elérése után (általában 2 nap) a vegetatív táptalajt vagy annak részeit használjuk nagyobb méretű szaporító táptalaj beoltására. A szaporító táptalaj közbenső méretű táptalaj, mely mint „nagy" inokulum nagy méretű fermentorok beoltására használható. Általában a szaporító táptalaj összetétele azonos, vagy megközelítőleg azonos a vegetatív táptalajéval. A kezdeti kis térfogatú vegetatív táptalaj mikroorganizmusok tenyésztésére szokásosan használt, tápanyagokban dús táptalaj lehet. Egy alkalmas vegetatív táptalaj, melyeken az S. chromofuscus NRRL 15098 jól növekedik, triptikáz-szója oldatból plusz 1% glükózból áll. A triptikáz-szója oldat kereskedelmileg kapható szójabab-kazein kivonat, amely pankreásszal emésztett kazeint, szója-peptont (szójabab-kivonat), NaCI-ot, K2HP04-ot és glükózt tartalmaz. Azonban az S. chromofuscus liofilizált pelletjét először ferde agaron is tenyészthetjük és — növekedés után — a ferde agárról a spórákat steril körülmények között vegetatív táptalajra visszük át. A vegetatív táptalaj tenyészetet azután a fent leírtak szerint használhatjuk a közbenső méretű szaporító táptalaj beoltására. A találmány szerinti ACE-bénítók előállítására használt mikroorganizmust Streptomyces chromofuscus egy új törzseként azonosították (Preobrashenskaya, Blinov és Ryabova 1957); Pridham, Hessetine és Benedict, „A guide for the classification of Streptomyces according to selected groups", Appl. Microbiol. 6, 52—59 (1957). Az új S. Chromofcscus törzset a nyilvánosság részére hozzáférhetően deponálták (1982. június 24) (Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Center, Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604) és az NRRL 15098 nyilvántartási számmal jelölték meg. 9 6 Az A58365 A- és B-faktort a fermentációs közegből izoláljuk és egymástól kromatográfiával választjuk el. A faktorok izolálását és szeparálását a következőképpen hajtjuk végre. A teljes fermentlevelet körülbelül pH 2,0-ig megsavanyítjuk, és a micélium és egyéb oldhatatlan anyagok eltávolítása céljából átszűrjük. A szűrés sebességének fokozása céljából kívánatos szűrési segédanyagot alkalmazni. Szűrés után a szűrtlé pH-ját lúggal, mint nátrium-hidroxiddal mintegy 7,0-re állítjuk be. Az inaktív semleges szennyezések eltávolítására szolgáló előzetes kromatografálásnál a szűrlevet nem-funkciós térhálós polimer gyantával, például polisztirol gyantával, mint Diaion HP-20-szal (Mitsubishi Chemical Co.) vagy XAD gyantával (Rohm and Hass, Philadelphia, PA) kezeljük. A semleges tápfolyadékot a gyantával megtöltött oszlopon átbocsátjuk, vagy pedig a gyantát megfelelő edényben hozzáadjuk a semleges tápfolyadékhoz és a tápfolyadékkal együtt keverjük az inaktív szennyezések adszorbeálása céljából. Ezen előzetes tisztításnál a használt gyanta mennyisége a tápfolyadék térfogatának mintegy 1/10-ét teszi ki. Előnyösen a gyantát a semleges tápfolyadékban mintegy 2 óráig keverjük, majd szűréssel elválasztjuk. A gyantával kezelt tápfolyadék pH-ját azután savval, mint sósavval körülbelül 2,0—3,0-ig csökkentjük, a megsavanyított tápfolyadékot lehűtjük és az inaktív csapadék eltávolítása céljából leszűrjük. Ezután a savas, tisztított tápfolyadékot nem-funkciós gyantán, előnyösen Diaion HP-20-on kromatografáljuk. A savas tápfolyadékot a HP-20 gyantával megtöltött oszlopon átbocsátjuk és az effluenst elöntjük. Miután az oszlopot híg savval, előnyösen 0,3% vizes hangyasavoldattal átmostuk, az A58365 faktorokat gradiens elúcióval oldjuk le; a gradiens kezdeti összetétele víz/hangyasav 99,7:0,3 térf%) és végső összetétele acetonitril/víz-hangyasav (20:79,7:0,3 térf.%). Az A-faktort a nagyszámú kezdeti, aktív frakcióban kapjuk meg, míg a B- és C-faktort a későbbi aktív frakciókkal eluáljuk. A kromatográfia lefolyását HPLC-elemzéssel követjük, a már leírtak szerint. Az A58365 A-faktort tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepároljuk. A maradékot savas gyantára, mint savas ciklusban (H+) lévő polisztirolszulfonsav gyantára, például Dowex 50W gyantára (Dow Chemical Co.) visszük fel. Az A-faktort a gyantáról több frakcióban, ionmentesített vízzel mossuk le. Az A-faktort tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepárlással koncentráljuk. A savas (pH 2—3), koncentrált A-faktort átszűrjük, majd fordított fázisú preparatív HPLC-vel tisztítjuk CI8-szilikagélen, mint oktadecilszilánozott Whatman LP-1 gyantán vagy Water’s Assoc. C18-szilikagélen. Az oszlopot először vizes hangyasavval (0,3: :99,7 térf.%), majd acetonitril/hangyasav/ /víz eleggyel (1,0:0,3:98,7 térf.%), végül ace-10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
