199168. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új makrolid-antibiotikum és az új antibiotikumot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
199168 seolusszal szemben Str. sp. Y-84,30967 melanoid pigmentet képez, a szénforrások hasznosításában világosan különbözik Streptomyces bikiniensis-től, végül fermentáláskor kalkomicint és a swalpamicinnek nevezett új antibiotikumot termeli. Az (I) képletü új antibiotikum egy új, 16-tagú makrolid-aglikont [(II) képlet) tartalmaz. A fenti megfigyelések alapján arra következtettünk, hogy az új mikroorganizmus egy új Streptomyces-fajtát képez. A törzset 1986. május 20-án a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen nevű törzsgyűjteményben (D-3400 Göttingen) DSM 3740 szám alatt letétbe helyeztük. Szakember számára világos, hogy a találmány nem erre az egy leírt mikroorganizmusra korlátozódik, hanem az említett mikroorganizmustól levezetett minden spontán vagy mesterséges mutánsra is kiterjed, amely az új antibiotikum termelésére képes. A találmány szerinti eljárás során a Streptomyces sp. Y-84,30967 (DSM 3740) mikroorganizmust 6,0 és 9,0 közötti pH mellett 18—40°C-on aerób körülmények között szén- és nitrogénforrásokat és szervetlen tápsókat tartalmazó közegben tenyésztjük, majd a vegyületeket a tenyészléből és a micéliumból ismert módon elkülönítjük. A tápközeg szénforrása lehet glükóz, keményítő, dextrin, glicerin, nádcukor, melasz és olaj, szójaliszt, élesztőkivonat, marhahúskivonat, malátakivonat, kukoricalekvár, pepton és kazein. Szervetlen sóként nátrium-klorid, magnézium-szulfát, ammónium-szulfát és kalcium-karbonát alkalmazható. Vas, mangán, réz, cink és kobalt szerepelhetnek nyomelemként. A Str. sp. Y-84,30967 (DSM 3740) mikroorganizmust előnyösen 25—30°C-on, különösen előnyösen 27°C-on és 6,5 pH mellett tenyésztjük. A fermentálást 40—50 órán át folytatjuk, utána megszakítjuk, mert ennyi idő után a hozam a legmagasabb. A fermentálást előnyösen süllyesztett tenyészetben végezzük. A fermentáció előrehaladását és az antibiotikum hatású makroiid-vegyüietek képződését a tenyészlé és a micélium Staphylococcus aureus 209 P tesztmikroorganizmusra kifejtett hatása alapján követhetjük. A swalpamicint a szűrletből, 6,0—7,5, előnyösen 6,5 pH mellett kalkomicinnel együtt szokásos módszerek segítségével, így vízzel nem elegyedő oldószerrel végzett extrahálás útján izolálhatjuk. Vízzel nem elegyedő oldószerként például kloroform, diklór-metán, n-butanol, etil-acetát vagy butil-acetát jöhet szóba. Az etil-acetátot előnyben részesítjük. Az antibiotikum-komplexet a micéliumból vagy az össztenyészléből szerves oldószerrel, például valamilyen ketonnal, előnyösen acetonnal extrahálhatjuk. Az acetonos kivonatot betöményítjük. A vizes rész pH-értékét 6,0 és 7,5 közötti, előnyösen 6,5 értékre állítjuk, és a vizes fázist a fent felsorolt 4 5 vízzel nem elegyedő oldószereket valamelyikével, előnyösen etil-acetáttal extraháljuk. A micélium és a szűrlet szerves extraktumait egyesítjük vagy külön-külön dolgozzuk fel. A swalpamicin kinyerésének egy további módszere adszorpción alapul. A folyadékot, például a tenyészet szűrletét vagy az új antibiotikumot tartalmazó oldószeres kivonatot oszlopkromatográfia vagy folyadékkromatográfia segítségével tisztítjuk alkalmas adszorpciós anyagok, így aktív szén, Diaion HP-20, XAD 4. alumínium-oxid, Kieselgél vagy Sephadex LH-2P felhasználásával. Az adszorpciós anyagról a vegyületet megfelelő oldószerrel, így kloroformmal metanollal vagy acetonnal, azok kombinációival vagy vizes elegyeive! eluáljuk. Az eluátumokat szárazra pároljuk. A swalpamicint és kalkomicint tartalmazó oldószeres extraktumokból, illetve a betöményített eluátumbó! az új vegyületet különböző módszerekkel kinyerhetjük, tovább tisztíthatjuk. Célszerűek például az adszorpciós és eluálós eljárások, aktív szén, Amberlit, XAD-4 és -7 (Rohm und Haas Co.) vagy Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries) felhasználásával, Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals AB) segítségével végzett gélszűrés, adszorpciós kromatográfiás módszerek alumínium-oxid és Kieselgél felhasználásával vagy e módszerek kombinációja. Alkalmas módszerek továbbá a vékonyréteg-kromatográfia, alkalmas adszorpciós anyagokkal, így Kieselgél C18 adszorbenssel végzett közép- és nagynyomású folyadékkromatográfia. Alkalmasan választott oldószer-rendszerrel végzett ellenáramú kromatográfia is célravezető lehet. A swalpamicin színtelen, amorf por, amely az alábbi oldószerekben oldódik: metanol, etanol, n-propanol, izopropanol, n-butanol, etil-acetát, n-butilacetát, aceton-, -etil-metil-keton, metil-izobutil-keton, diklór-metán, kloroform, dimetil-formamid, dimetil-szulfoxid. A swalpamicin hexánban, petroléterben és vízben rosszul vagy egyáltalán nem oldódik. A kész Kieselgél-lemezen (Merck, Darmstadt, cikkszám 5554) végzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatban az alábbi Rp -értékeket találtuk swalpamicinre és kalkomicinre: 6 swalpamicin kalkomicin oldószer Rpértékek metanol és kloroform 7:93 arányban 0,5 0,42 metanol és kloroform 1:9 arányban 0,6 0,53 etil-acetát 0,7 0,46 Az 1. ábra a nagynyomású folyadékkromatográfiás elemzés alakulását mutatja, ahol az alábbiakban megadott paraméterek mellett mértük a retenciós időket: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
