199160. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GnRh antagonista ciklusos dekapeptidek előállítására
199160 A fenti eljárást alkalmazzuk a találmány szerinti eljárásban az első aminosav kapcsolása után valamennyi aminosav kapcsolására. Minden további aminosav esetében NaBoc védőcsoportot alkalmazunk. Az N°Boc-ß-D-2-Nal egységet a szakirodalomban ismert módon állítjuk elő, vagy kereskedelemből szerezzük be. Az Arg egység oldalláncát To^-csoporttal védjük. A Cys-egység szulfinil-csoportj áriak védésére MeOBzl-csoportot alkalmazunk. A terminális aminosavként N°-Boc-p-D-2-Nal-egységet vezetünk be. A Boc-Arg(Tos) egység esetében, amelynek oldhatósága diklór-metánban alacsony a kapcsolás során, DNF: CH2Cl2 oldószer-elegyet alkalmazunk. Miután az N-terminális a-amino-csoport védőcsoportját trifluor-ecetsav (TFA) segítségével eltávolítjuk, nagy feleslegben alkalmazott ecetsavanhidrid segítségével diklórmetánban acetilezzük. A peptid gyantáról való lehasítását, és a teljes védőcsoport-eltávolítást az oldalláncúkon 0°C-on hidrogén-fluorid segítségével könnyen elvégezhetjük. A hidrogén-fluoridos kezelés előtt anizolt adunk a reakcióelegyhez savkötőként. Miután a hidrogén-fluoridot vákuumban eltávolítjuk, a gyantát 50%-os ecetsavval extraháljuk, és a mosófolyadékot liofilizáljuk, így porszerű peptid nyersterméket kapunk. A pepiidet ezután körülbelül 22°C-on 24 óráig levegőn oxidáljuk, és minden molekulában a Cys-egységek között diszulfid-kötést hozunk létre. A peptid tisztítását CMC (Whatman CM 32; 0,05—0,3 n NH4OAc, 50/50 metanol-víz; gradiens elúció) oszlopon ioncserélő kromatográfia, majd gélszerű oszlopon megoszlásos kromatográfia (elúció: butano-0,1 n ecetsav, 1:1 térfogatarány) segítségével végezzük. A peptid különböző oldószerrendszerekben végzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatok, valamint trietil-ammónium-foszfát-oldat és acetonitril alkalmazásával végzett reverz fázisú nagynyomású folyadék-kromatográfiás vizsgálat szerint homogén. A kapott, tisztított peptid aminosav analízise megfelel a megadott szerkezetnek, és az egyes aminosavakra egészszámú értéket ad a peptidláncban való előfordulásuk tekintetében. Az optikai forgatóképességet fotoelektromos polariméterrel határoztuk meg: [a]p2=—37,8°dz 1 (c=l, 50% ecetsav). A 2. számú peptidet, amelyet a 4- és 10- -helyzetű egységek között létrehozott amid-kötés révén ciklizálunk, a 4,133,805 számú, vagy a 4,161,521 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírt eljárással állíthatjuk elő. Például alkalmas eljárás az alábbi: Az alábbi közbenső terméket állítjuk elő a gyantán: Ac-ß-D-2-Nal-(4Cl)D-Phe-D-3-Pal-daP(Z) - -Arg(Tos) -D-3-Pal-Leu-Arg(Tos) -Pro-Asp(OBzl)-MBHA gyanta. A védőcsoportok eltávolítását, a lenasítást és a ciklizálást az alábbiak szerint végezzük. 4 g védett peptidil-gyantát szobahőmérsékleten 40 ml dimetil-formamidban szusz-11 pend álunk, és keverés közben l ml vízmentes hidrazint (30—40 x felesleg) adunk hozzá. A reakcióelegyen zárt edényben folyamatos keverés közben 48 óráig nitrogéngázt buborékoltatunk keresztül. A gyantát leszűrjük, dimetil-formamiddal, vízzel, diklór-metánnal és metanollal mossuk, végül mégszárítjuk. 4 g védett peptid-hidrazid-gyant’át 1,5 ml anizol jelenlétében 0°C-on 60 percig 10—15 ml desztillált hidrogén-fluoriddal reagáltatunk, hogy a maradék védőcsoportokat eltávolítsuk, és a peptidet a gyantáról lehasítsuk. Ezután a hidrogén-fluoridot nagyvákuumban eltávolítjuk, es a peptidet vízmentes etil-éterből kicsapjuk. A szilárd anyagot leszűrjük, 50 ml acetonitril : víz (1:1) elegyben oldjuk, majd liofilizáljuk. Ezután a ciklizálás előtt az 1. számú peptid esetében leírt módon RP-HPLC módszerrel tisztítjuk. 1000 mg peptid-hidrazidot oldunk 15 ml dimetil-formamidban, —25°C-ra hűtjük, és nitrogéngázzal átbuborékoltatjuk. Ezután 0,56 ml (körülbelül 2,25 mmól) 4 n dioxános sósav-oldatot adunk hozzá, majd 105 mikről (körülbelül 0,78 mmól) izoamil-nitritet csepegtetünk az elegyhez 10 perc alatt. A reakcióelegyet 3 óráig —25°C-on keverjük, előhűtött (—25°C) 1000 ml dimetil-formamiddal hígítjuk, és részletekben annyi N,N-diizopropil-etil-amint adunk hozzá, hogy pH-értéke 7,8 legyen. A pH-értéket többször ellenőrizzük és újra beállítjuk. Az oldatot 3 napig 4°C-on tároljuk, majd nagyvákuumban bepároljuk. A maradékot etiléterrel eldolgozzuk, a szilárd anyagot szűrjük és vákuumban megszárítjuk. A peptidet in vivo vizsgáljuk, de vizsgálhatók in vitro is. Amennyiben in vitro vizsgálatot végzünk, ezt a vizsgálat előtt 4 napig tenyésztett, elkülönített, patkány hypophisishez tartozó mirigy sejtek alkalmazásával hajtjuk végre. A peptidek alkalmazására kapott LH szintet mérjük; patkány LH esetében alkalmazott, specifikus radioimmun kísérlettel. A kontroll lemezek csak 3 nanomólos GnRH kezelést kapnak; a kísérleti lemezek 3 nanomólos GnRH és/vagy valamely standard öszszehasonlítás céljából alkalmazott antagonista (pl. Ac-dehidro-Pro1. (4F)D-Phe2, D-Trp3'6- -GnRH) vagy a vizsgált peptid 0,01 —10 nanomólos kezelést kapnak. A csak GnRH-val kezelt minták LH kiválasztását hasonlítjuk össze a peptiddel és GnRH-val kezelt mintákéval. A vizsgált peptid 3 nanomólos GnRH által kiváltott LH termelést csökkentő hatását hasonlítjuk össze a standard peptidekével. Az in vivo vizsgálat során meghatározzuk a nőstény patkányok peteérésének megakadályozásábani hatásosságot. A vizsgálatban az ivarzás napján adott számú, például 5—10, arányi nőstény, 225— 250 g súlyú Sprague—Dawley patkányt oltunk be a vizsgált peptid fiziológiás sóoldatában, vagy balcteriosztatikus vízben készült oldatával, amely adott dózisban tartalmazza a hatóanyagot. Az ivarzás napja a pete-7 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
