198964. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glikopeptid-antibiotikumok és ezeket tartaalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

27

IIU 1989S4 B

28

ammónium-dihidrogén-foszfát/acetonitril,

88:12 arányú elegyet használunk.

Az egyes frakciókat analitikai HPLC-vel elemezzük. Az A82 846A antibiotikumban és az A82 846B antibiotikumban feldúsult frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk (6-9., illetve 10-17. frakciókat).

Az előzőekben leirt elödúsitás szerint 2x30 g nyers A82 846 antibiotikumból nyert A82 846A antibiotikumban feldúsított terméket sótalanitás céljából 1750 ml Diaion IIF-20 SS oszlopra visszük, amit vízzel mosunk, 0,5% ecetsavat tartalmazó, víz/izopropanol, 95:5 eleggyel eluálunk, és a frakciókat analitikai HPLC-vel elemezzük. Az A82 846 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk, fagyasztva szárítjuk 7,4 g A82 846A antibiotikumban gazdag preparátumot nyerve.

7,2 g fenti preparátumot vízben oldunk és 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfátban levő LP-l/Cis szilikagél preparativ oszlopra visszük. Az oszlopot gradiens elúcióval kromatografáljuk, a kezdeti eluens 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát a befejező eluens 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát puffer/ /acetonitril, 9:1 arányú elegye. Az elúciós sebesség percenként 48 ml. A frakciókat analitikai HPLC-vel vizsgáljuk, 254 nm-nél detektálva. Az első 10 liter eluens lejövetele után 500 ml-es frakciókat gyűjtünk.

Az A82 846A (4-10.) és az A82 846B (12- -20.) antibiotikumokat tartalmazó frakciókat egyesítve, csökkentett nyomáson bepároljuk. Három sorozat A82 846A antibiotikumot tartalmazó preparátumát egyesitjük és 1750 ml Diaion HP-20 SS oszlopra visszük sótalanitás céljából. Az oszlopot vízzel mossuk, az A82 846A antibiotikumot 0,5% ecetsavat tartalmazó, víz/izopropanol, 95:5 eleggyel eluáljuk. Az elúciót analitikai HPLC-vel követjük nyomon. Az A82 846A antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk és fagyasztva szárítjuk, 7,9 g tisztított A82 846A antibiotikumot nyerve.

Az A82 846A antibiotikum IR spektrumét (KBr) az 1. ábrán mutatjuk be; a tioglicerinben felvett FAB-tömegspektrumát a 4. ábrán láthatjuk; a 7. ábra az A82 846A-hidroklorid metil-szulfoxid-d6-ban 60 °C hőmérsékleten felvett NMR spektrumát mutatja (Bruker AM500 spektrométer, HDO szupresszált).

Az A82 846B tisztításához 3 preparativ HPLC kromatográfiát futtatunk le az A82 846A és az A82 846B antibiotikumok szétválasztására. Az előzőekben leirt eljárás szerint kapott, A82 846B antibiotikumban feldúsított frakciókat egyesítjük és 1750 ml Diaion HP-20 SS oszlopon sótalanítjuk. Az oszlopot vízzel mossuk és 0,5% ecetsavai tartalmazó víz/izopropanol 95:5 eleggyel eluálunk. Az elúciót analitikai HPLC-vel követjük nyomon. Az A82 846B antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és fagyasztva szárítjuk, 8,8 g tisztított A82 846B antibiotikumot nyerve.

16

Az A82 846B antibiotikum IR spektrumát (KBr) a 2. ábrán, lioglicerinben felvett FAB-lömegspektrumát az 5. ábrán, az acetatjának metil-szulfoxid-d6-ban, 60 °C hőmérsékleten felvett NMR spektrumét (Bruker AM500 spektrométer) a 8. ábrán mutatjuk be,

A sótalanitási eljárásokat végezhetjük úgy is, hogy a Diaion HP-20 gyantára vitt anyagot 0,1% ecetsavat tartalmazó, metanol/víz, 4:1 eleggyel eluáljuk.

6. példa

Az A82 846C antibiotikum előállításához először A82 846 antibiotikumot termelünk, majd az A82 846A, B és C komponenseket elválasztjuk és az A82 846C komponenst tisztítjuk az alábbiak szerint:

Az 1. példában ismertetett tankfermentáció 461 liter fermentlevének kémhatá- U. 5 n riákrium-hidroxiddal pH=10,5 értékre üdítjük be, és 3% Hyflo Supercelt hozzáadva szűrjük. A 430 liter szűrlet kémhatását 5 n sósavval pH=7 értékre állítjuk be, és 10 liter Dowex-SFS-43 278 (NH4M gyantára visszük. Az oszlopot 50 liter vízzel mossuk, az aktívanyagot 50 liter 0,05 n ammónium-hidroxiddal eluáljuk, 4 literes frakciókat gyűjtve. Az elúciót biológiai érték méréssel analizáljuk. Az aktiv frakciókat (1-7.) egyesítjük, csökkentett nyomáson kb. 1700 ml térfogatra tömény itjük, majd fagyasztva szárítva 283,9 g nyers A82 846 antibiotikum preparátumot nyerünk.

2 g nyers, A82 846 antibiotikum terméket vízben oldunk és 5,08x114,3 cm méretű rozsdamentes acél preparativ HPLC oszlopban 2110 ml LP-1/Cis szilikagél oszlopra viszünk, amit 1% ammónium-dihidrogén-foszfátban készítettünk előzőleg el. Az oszlopot gradiens elúciónak vetjük alá, a kezdeti eluens 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát oldat, a végső 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát/

/acetonitril, 92:8 elegy. Átfolyási sebesség 70 ml/perc. 400 ml-es frakciókat gyűjtünk és 254 nm-nél detektálunk.

Különválasztjuk az A82 846A (11-14.) az A82 846C (16-20.) és az A82 846B antibiotikumot (21—25.) tartalmazó frakciókat, majd a megfelelőket egyesítjük.

Az A82 846C antibiotikumot tartalmazó egyesített frakciókat 200 ml térfogatra töményitjük és 7x45 cm-es üvegoszlopban 1800 ml Diaion HP-20 gyantán sótalanítjuk. Az aktiv anyagot 0,1% ecetsavat tartalmazó, metanol/ /viz, 4:1 eleggyel eluáljuk. Átfolyási sebesség percenként 25 ml. 1 literes frakciókat gyűjtünk. Az A82 846C antibiotikumot tartalmazó frakciókat (9-12.) egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és fagyasztva szárítjuk, 662,2 mg félig tisztított A82 846C antibiotikum terméket nyerve.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65