198964. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glikopeptid-antibiotikumok és ezeket tartaalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
25 HU 198964 B 26 glükóz 2.5% szójaliszt 1.5% burgonya dextrin 3.0% kalcium-karbonát 0.25% melasz 0.3% savval hidrolizált kazein* ‘ 0.5% ionmentes vízzel 1 literre feltöltve *Hy-Case, Sheffield Chemical Co. Sterilizálás előtt a táptalaj kémhatását 10 pH=7,5 értékre állítjuk be nátrium-hidroxid oldattal. A beoltott táptalajt 250 ml-es széles szájú Erlenmeyer lombikban rázatjuk 30 °C hőmérsékleten 4-5 napon keresztül. Az 15 5,08 cm kitérésű rázógép forgási sebessége 250 fordulat percenként. b) Tankfermentorban történő termelés: hogy kellő mennyiségű oltóanyaghoz jussunk, 10 ml, az előző a) pontban leirt módon előál- 20 ütött inokulum tenyészettel beoltunk 400 ml újabb táptalajt, melynek összetétele megegyezik az első lépéses tenyészet táptalajának összetételével. Ezt a második lépéses vegetativ közeget 2 literes széles szájú Erlen- 25 meyer lombikban rázatjuk 30 °C hőmérsékleten 48 órán át. Az 5,08 cm kitérésű rázógép forgási sebessége 250 fordulat percenként. 1000 ml igy kapott második lépéses vegetatív tenyészettel oltunk be 100 liter steril 30 termelő táptalajt, melyet az a) pontban leií— tak szerint állítunk össze, azzal a különbséggel, hogy literenként 0,3 g P-2000 habzásgátlót is adunk hozzá. A beoltott táptalajt 165 literes kevert tankfermentorban fermen- 35 táljuk 30 °C hőmérsékleten 90-100 órán át. A percenként 80-as fordulatszámmal kevert tenyészet levegőztetését úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigénszint a levegőtelítettségi érték 50%-a felett legyen. 40 b) lépést elvégezhetjük úgy is, hogy 4536 literes tankfermentorban levő 3400 liter termelő táptalajt beoltunk megfelelő mennyiségű vegetatív oltóanyaggal. 45 2. példa Az A82 846 antibiotikum termelését A82 846.1 törzzsel elvégezhetjük úgy, hogy 50 liofilizált állapotban vagy folyékony nitrogén alatt tartott Nocardia orientalis NRRL 18 099 törzzsel az 1. példában leírtak szerint végzünk fermentációt, azzal a különbséggel, hogy a termelő táptalajt az alábbi összetételű: glükóz 1.0% burgonya dextrin 2.0% pepton* 1.0% kalcium-karbonát 0.2% melasz 2.0% ionmentes vízzel 1 literre feltöltve pH beállítás nincs. *Bacto-pepton (Difco Laboratories). 3. példa Az A82 816 antibiotikum előállítása A82 816.2 törzzsel: a liofilizett állapotban vagy folyékony nitrogén alatt eltartott Nocirdia orientalis NRRL 18 100 törzzsel az 1. példában leírtak szerint végzünk fermentálást, azzal a különbséggel, hogy a savval hidrolizált kazein helyett Amicase-t (Sheffield Chemical Co.) használunk. 4. példa A nyers A82 816 antibiotikum előéllitásá- 1 oz 4200 liléi-, az A példa b) pontjában leírt. ik szerint előállított fermentlé kémhatását 4 n nátrium-hidroxiddal pH=10,5 értékre állítjuk be, és hozzáadunk 3% Celite 545-öt (szűrést elősegítő adalék). A keveréket présszűrőn szűrjük, a kiszűrt anyagot vízzel mossuk. A szűrletet és a mosóvizet egyesítjük (4200 liter), a kémhatását 5 n sósavval (vagy kénsavval) pll-7 értékre állítjuk be és Powex-SFS-43 278 (NH*) gyantára visszük. 10 I ker gyantát számítunk 200 liter szűrletre. Az oszlopot 750 ml/perc sebességgel eluáljuk. A frakciókat biológiai értékméréssel - Bacillus subtilisl használva tesztorganizmusként - vagy HPLC-vel vizsgáljuk. Az oszlopot 5 oszlop-térfogatnyi vízzel mossuk, 100 literes frakciókat gyűjtve. Az aktív anyagot 5 oszlop-térfogatnyi C,05 n ammónium-hidroxiddal eluáljuk a gyantáról, 25 literes frakciókat gyűjtve. Az A82 846 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson kb. 30 literrel töményitjük. Ezt az oldatot visszük iá 10 liter, vizes gyantaágyban levő Diaion 1 P-20 oszlopra. Az oszlopot 3 oszlop-térfogatnyi vizzel mossuk 300 ml/perc átfolyási sebességnél. A vizes mosót eldobjuk. Az aktív anyagot viz/izopropanol, 95:5 eleggyel, mely ] ,0% ecelsavat tartalmaz eluáljuk percenként 100 ml-es átfolyási sebességnél. 4 literes frakciókat gyűjtünk, melyeket biológiai érték méréssel vagy . HPLC-vel vizsgálunk. Az A82 846 antibiotikumot tartalmazó frakciókat (6-14.) egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és fagyasztva szárítjuk, 356 g r yei's A82 846 antibiotikumot nyerve. P. példa Az A82 846A és az A82 846B antibiotikumok elválasztásához 30 g a 4. példában leírtuk szerint nyert A82 846 antibiotikumot 500 ml vízben oldjuk és 30 literes, LP-1/Cis szilikagéllel töltött rozsdamentes acéloszlopra visszük, melyet 1%-os ammónium-dihidrogén- foszfáttal ekvilibráltunk. Az elúciót 60 liter 1%-os ammóriium-dihidrogén-foszfát oldattal kezdjük, majd a következő 60 literben 1% 15
