198953. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enkefalináz gátló hatású glikopeptidek, aminosav származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
t HU 198953 B 2 pH-érték 8,3 Sterilizálás: 120 *, 20 perc Inkubálás: 18 °C, 2 nap rázógép: 150 ford/perc és 5 cm amplitúdó Az így kapott tenyészetet 48 órával Később a 200 liter térfogatú második előtenyészet oltóanyagaként használjuk fel. A második előtenyészet szintén az előfokozat tápközegén nő. A sterilizálási idő 30 perc. A tenyészetet 28 °C-on, 0,1 wm levegőztetési arány mellett, 5 m/sec kerületi sebességgel végzett keverés közben inkubáljuk. Az így kapott tenyészettel a 2000 liter térfogatú termelő közeget oltjuk be. A termelő tenyészet tápoldata Földimogyoróliszt 30,0 g/l Cornsteep solids (gyártja: Sigma, NSZK) 10,0 g/l Kukoricakeményítő 20,0 g/l Dextrin 40,0 g/l (NH4)2S04 5,0 g/l MgS04.7H20 5,0 g/l CaCü3 8,0 g/l pH-érték 6,8 Sterilizálás 120 “C, 50 perc A termelő tenyészetet 28 °C-on, 0,6 wm levegőztetési arány mellett 4 m/sec kerületi sebességgel végzett keverés közben fermentáljuk. Az inhibitorok keletkezése 4 nap múlva indul meg, koncentrációjuk 10-12 nap múlva eléri a maximumot. A fermentációs maximum elérése után a fermentálást megszakítjuk. Ilyenkor a tenyészlé literenként 5 — 10 jig enkasztin-komplexet tartalmaz. 5 10 15 20 25 30 35 2. példa Az enkasztin izolálása a fermentléből Az 1. példa szerint előállított 2000 liter fér- 40 mentiéből szűrőpréssel elválasztjuk a sejttömeget, majd a tiszta folyadékot kétszer 600 — 600 liter n-butanollal extraháljuk. Az így kapott vizes fázist vákuumban esőáramú bepárlóban 150 literre betöményítjük, és az így kapott koncentrá- 45 tumot 600 liter metanollal meghígítjuk. Ekkor világos, pelyhes csapadékot kapunk, amelyet centrifugálással leválasztunk és eldobunk. A vizes metanolos felülúszót ismét vákuumban bepároljuk és megszárítjuk. 18 kg barna, ragadós 50 anyagot kapunk. Vizes közegben 70 liter kationcserélőn (Dowex 50 WX 2 /savas forma/) adszorbcáljuk, nfiajd az ioncserélőt tiszta vízzel mossuk és az inhibitort 0,5 mól ammónium-hidroxid oldattal deszorbeáljuk. Az enkefalináz-gátló hatá- 55 sú eluátumot összegyűjtjük és fagyasztva szárítjuk (3,5 kg). Ebből a termékből analóg munkafolyamattal 70 liter anioncserélőn (amberlite IRA-68) az amfoter vegyületeket elválasztjuk. Az enkasztinokat 0,5 mól ecetsawal eluáljuk. Az in- 60 hibitor eluátumot fagyasztva szárítjuk, így 320 g száraz terméket kapunk. Ezután Sephadex G-15 gélkromatográfíával, valamint az aktív anyag fagyasztva szárításával 30 g enkasztín-nyerstermékét nyerünk. 65 3. példa Az enkasztin komponensek elkülönítése A 2. példa szerint kapott anyag 150 mg-ját 1 ml vízben feloldjuk és fordított fázisú Kieselgél (RP 18) adszorbenssel töltött 3,2 x 25 cm belső méretű acélkolonnára visszük. Az oszlopot először 0,05%-os trifluorecetsawal 40 percen keresztül eluáljuk, ezt követően 0,05%-os trifluorecetsawal lineáris acetonitril-gradienst alkalmazunk. A kolonnából távozó folyadékot 200 nm hullámhossznál végzett ultraibolya abszorpció méréssel ellenőrizzük. Az oszlopról egymástól élesen elkülönülő anyagok egész sorát eluáljuk. A megfelelő frakciókat kiílön-külön összegyűjtjük, majd fagyasztva szárítjuk, majd vizsgáljuk. A 2., 3., 4., 5., 7., 8., 11., 13., 16., 18. és 21. csúcsok anyagai enkefalinázzal szemben gátló hatást mutatnak. Az egyes csúcsok szárított anyagával végzett mérések eredményeit az alábbiakban ismertetjük 3. csúcs: (retenciós idő: 6 perc 8 másodperc): Az enkasztin AD-t tatalmaz. Aminosav analízis alapján ekvimoláris mennyiség analint és aszparaginsavat tartalmaz. Az FAB-tömegspektrum alapján molekulatömege 366, összegképlet: C1JH22N2O10 x A 2D-NMR vizsgálat alapján a már megadott szerkezetet kapjuk. 4. csúcs: (retenciós idő: 5 perc 21 másodperc): kis mennyiségű enkasztin VD-t tartalmaz, amelynek molekulatömege 394, összegképlete C15H26N2O10. Az 1. ábra az enkasztin VD *H-NMR-spektrumát mutatja. 7. csúcs: (retenciós idő: 7 perc 20 másodperc): az enkasztin AE-t tartalmazza, molekulatömeg 380, összegképlete Ci4H24N2Oio. 11. csúcs: (retenciós idő: 8 perc 10 másodperc): az enkasztin VE-t tartalmazza, molekulatömeg 408, összegképlete Cn^s^Oio, amely a valin és a glutamin aminosavakat tartalmazza. 13. csúcs (retenciós idő: 18 perc 40 másodperc): az enkasztin ID-t tartalmazza, molekulatömeg 408, összegképlete C^Hjg^Oio, amely az He és Asp aminosavakat tartalmazza. 16. csúcs: (retenciós idő: 22 perc): az enkasztin lE-t tartalmazza, molekulatömeg 422, összegképlet C17H30N2O10. 4. példa n-(l-dezoxi-fruktopiranóz-l-il)-izoleucil-aszparaginsav előállítása 30 g vízmentes D-glükóz és 3 g izoleucil-aszparaginsav 1,2 liter metanollal készített oldatához 200 mgt nátrium-hidrogén-karbonátot adunk. Az elegyet 2 órán keresztül visszafolyató hűtő alatt melegítjük. A reakcióban keletkezett vizet butanollal ledesztilláljuk, majd a metanollal hígított reakcióelegyet még egyszer 2 órán át melegítjük. A kapott oldatból az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a 300 ml vízben felvett maradékot 5 cm átmérőjű, 600 ml térfogatú, QAE-Sephadex A - 25 adszorbenssel töltött oszlopra visszük. Az átfolyó oldószerben a felesleges glükóz található. Az N-(l-dezoxifrukt6z-l-ii)-izoleucil-aszparaginsavat 0 mól/1 koncentrá-5
