198952. lajstromszámú szabadalom • Eljárás emlős agyalapi mirígy eredetű növekedési hormon kibocsátást elősegítő faktor (PGRF) előállítására
1 HU 198952 B 2 mérsékleten fél órán át, majd 0 °C hőmérsékleten fél órán át végezzük. A HF eltávolítása után nagyvákuumban, a megmaradó gyanta-peptid komplexumot váltakozva mossuk száraz dietil-éterrel és kloroformmal, és azután a pepiidet gázmentesílett 2 n vizes ecetsavval leoldjuk. Az ecetsavas oldat liofilezésével fehér, vattaszerű anyaghoz jutunk. A lehasított és védőcsoportoklól megszabadított pepiidet azután 30%-os ecetsavban oldjuk és Sephadex G-50 en finom gélszűrésnek vetjük alá. A pepiidet azután tovább tisztítjuk CM-32 karboxi-melil-cellulózon (Whatman) kation-cserélő kromatográfíával (1,8 x 18 cm, Vágy= 50 ml) konkáv gradienst alkalmazva olyan módon, hogy 1 1 0,4 móVliteres ammónium-acetát-oldatot (pH 6,5) csepegtetünk egy 400 ml 0,01 mól/iitcres ammónium-acetát oldatot (pH = 4,5) tartalmazó keverőedénybe. Az utolsó tisztítási lépést megoszlási kromatográfíával hajtjuk végre n-butanol:etanol:piridin: 0,2% n-ecetsav (4:1:1:7) oldószer-rendszerrel, Sephadex G —50 finom hordozón (Pharmacia). A tisztítás részletei megtalálhatók Ling és munkatársainak közleményében [Biochem. Biophys. Rés, Commun, 95, 945 (1980)]. A kromatográfiás frakciókat vékonyréteg kromatográfiával (TLC) gondosan követjük és csupán azokat a frakciókat gyűjtjük össze, amelyek alapvetően tisztának mutatkoznak. Aminosav-analíziseket is végzünk hidrolízist követően leforrasztott csövekben az Anal. Biochem.. 126, 144- 156 (1982) irodalmi helyen leírt módszert alkalmazva, Liquimat 111 aminosav analizátorral dolgozva. Az aminosav-analízis célja, hogy ellenőrizni lehessen, vajon a helyes szekvenciát nyertük-e. A következő eredményt kapjuk: Asx(3,62), Thr(0,75), Se(3,5), Glx(6,83), Gly(2,87), Ala(5,10), Val(0,9), Met(l,23), Ile( 1,84), Leu(5,045), Tyr(2,09), Phe(0,91), Lys(2,31) és Arg(6,61). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciát. 2 2, példa A PGRF (1 -40) — amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-OH — szintézisét lépései.xénti módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesiser! használva klórmetilezett gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TL.C-vel és nagynyomású folyadék-kromatográfiával (HPLC) vizsgálva. Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-e. Az analízis a következő eredményeket adja: Asx(3,89), Thr(0,88), Ser(3,66), Glx (7,04), Gly(3,07), Ala(4,02), Val(0,96), Met (1,01), Ile(l,86), Leu(4,28), Tyr(2,0), Phe(0,86), Lys(2,24) és Arg(4,15). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciát. 2/a. példa A PGRF (1 — 34) szabad sav — amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-GIn-Gln-Gly-Glu-Ser-OH és amely nem tartozik az igényelt oltalmi körbe — szintézisét lépésenként módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesisert használva kíór-metilezett gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A pepiidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vel vizsgálva. Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-e. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(2,87), Thr(0,78), Ser(3,78), Glx(5,U), Gly0(l,93), Ala(3,03), Va!(0,88), Met(0,96), Ile (1,88), Leu(4,14), Tyr(2,05), Phe(l,07), Lys (2,29) és Arg(3,22). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciát. 2/b. példa A PGRF (1-31) szabad sav — amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-OH és amely nem tartozik az igényelt oltalmi körbe — szintézisét a lépésenként! módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesisert használva klór-metilezett gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC- vel vizsgálva. Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-e. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(2,73), Thr(0,75), Ser(2,77), Glx(3,95), Gly(0,98), Ala(3,06), Val(0,80), Met(0,98), Ile (1,77), Leu(4,28), Tyr(2,23), Phe(l,14), Lys (2,34) és Arg(3,22). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciát. 2/c. példa A PGRF (1 — 28 szabad sav — amelynek képlete N-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-OH és amely nem tartozik az igényelt oltami körbe — szintézisét lépésenkénti módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesisert használva klór-metilezett gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vel vizsgálva. Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-e. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(2,66), Thr(0,73), Ser(2,66), Glx(l,98), Gly(0,81), Ala(2,89), Val(0,90), Met(l,15), Ile (1,72), Leu(4,14), Tyr(2,43), Phe(l,58), Lys (2,15) és Arg(2,19). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciát. 3. példa A PGRF (1-44) amid - amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
