198952. lajstromszámú szabadalom • Eljárás emlős agyalapi mirígy eredetű növekedési hormon kibocsátást elősegítő faktor (PGRF) előállítására
1 HU 198952 B 2 -Arg-Lys-Val-Lcu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 szintézisét lépésenkénti módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synlhesisert használva MBHA-gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidel alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vel vizsgálva. Aminosav-analí/ist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon a korrekt szekvenciát nyertük el. Az analízis a következő eredményt adja: Asx = 3,75), Thr(0,80), Ser(3,60), Glx (6,98), Gly(3,16), Ala(5,04), Val(0,77), Met (1,02), Ile(l,79), Leu(5,41), Tyr(2,03), Phe (0,84), Lys(2,39), és Arg(6,43). Az analízis igazolja a korekt szekvenciát. 4, példa Egy PGRF analóg — amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ala-Asn-Gln-Glu-Ser-Gly-Arg-OH — szintézisét lépésenkénti módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesise« használva klór-metilezett gyantán, amely a Láb Systems, Inc-től szerezhető be, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk. Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-e. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(4,35), Thr(l,06), Ser(3,80), Glx(7,53), Gly(2,96), Ala(4,05), Val(0,97), Met(0,86), Ile (1,94), Leu(3,70), Tyr(2,05), Phe(l,06), Lys (2,06) és Arg(3,53). Az analízis igazolja a koirekt szekvenciát. 5, példa A PGRF (1—40)-amid — amelynek képlete -H-Tyr-Ala-Asp-Ala-IIe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2 — szintézisét lépésenkénti módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesise« használva MBHA gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vd vizsgálva. Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-c. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(3,76), Thr(0,88), Ser(3,68), Glx(6,89), Gly(3,12), Ala(4,08), Val(0,88), Met(l,36), lie (1,76), Leu(4,24), Tyr(2,00), Phe(0,80), Lys (2,32) és Arg(4,16). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciái. 6, példa A PGRF (1-37) szabad sav — amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Scr-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Lcu-Lcu-Gln-Asp-Ile-met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-OH, és amely nem tartozik az igényelt oltami körbe — szintézisét lépésenkénti módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesiser! használva klór-metilezett gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vel vizsgálva. Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-e. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(3,92), Thr(G,79), Ser(3,62), Glx(7,05), Gly(l,797), Ala(3,17), Val(l,03), Met(l,0), He (1,91), Leu(4,37\ Tyr(l,86), Phe(0,76), Lys (2,15) és Arg(3,4ü). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciát. 6/a. példa A PGRF (1-37) amid - amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln 'sp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-GIy-Glu-Ser-Asn-GIn-Glu-NH2, és amely nem tartozik az igényelt oltalmi körbe — szintézisét lépésenkénti módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesise« használva MBHA gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vel vizsgálva. Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát nyertünk-e. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(4,02), Thr(0,80), Ser(3,49), Glx(6,90), Giy(l,92), Aia(3,08), Val(l,05), Met(l,01), Ile (1,77), Leu(4,05), Tyr(2,02), Phe(l,14), Lys (2,50) és Arg(3,27). Az analízis igazolja a korrekt szekvenciát. 7. példa A peptidek növekedési hormon felszabadítását elősegítő hatásának meghatározása in vitro méréseket végzünk, a 2. példa szerint előállított szintetikus PGRF (1 —40)-et tisztított natív PGRF (l-40)-nel és GRF Referencia Standarddal hasonlítjuk össze, amelynek hatásossága ismert a növekedési hormon felszabadításának elősegítésében agyalapi mirigy sejtekből. A GRF Referencia Standard-ot Brazeau és munkatársai írták le és definiálták [Endocrinology, 110. kötet, A 538 (1982)]; ez olyan mennyiségű, patkány hipotalamus eredetű preparátumot jelent, amely maximális válaszfelét idézi elő a növekedési hormon (GH) felszabadítás vonatkozásában, egyréteges agyalapi mirigy sejttenyészetben végzett biológiai meghatározásban. Olyan tenyészeteket használunk, amelyek négy-öt nappal korábban eltávolított patkány agyalapi mirigy sejtjeit tartalmazzák. Mind meghatározott standard tápközeget tartalmazó, mind növekedési hormon kiválasztásához optimálisnak tekintett tápközeget alkalmazunk az összehasonlító vizsgálatban, azzal az általános módszerrel dolgozva amelyet Brazeau és munkatársai írtak le (Regulatory Peptides, 1, 255, 1981). A vizsgálandó vegyülettel történő inkubálást 3-4 óra hosszat végezzük, és a tápközegből alikvotokat véve meghatározzuk az immunreaktiv GH(ir GH) tartalmat egy jól ismeri radioimmun-méréssel. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
