198952. lajstromszámú szabadalom • Eljárás emlős agyalapi mirígy eredetű növekedési hormon kibocsátást elősegítő faktor (PGRF) előállítására
1 HU 198952 B 2 aktív fragmenseknek tartalmaztok kell az aktivitáshoz szükséges szekvenciát az N-terminálisnál. 1. példa A PGRF (1 — 44) szabad sav — amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Gln-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-OH-szintézisét lépésenként hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesiser-t használva klórmetilezett gyantán, amely a Láb Systems, Inc. terméke, és amely 0,9 mólekvivalens Cl-t tartalmaz grammonként. A BOC-Leu kapcsolódását a gyantához Monahan és munkatársainak általános módszereivel hajtjuk végre (Biopolymers, 12. kötet (1973) 2513- — 2519), ez a módszer mintegy 0,22 mmól Leu helyettesítést jelent 1 g gyantán. Minden felhasznált oldószert gondosan gázmentesítünk valamely inert gáz, előnyösen hélium átbuborékoltatásával, az oxigén eltávolítása érdekében, amely a kén nemkívánatos oxidációját okozhatja a Met gyökön. A peptidláncot a védőcsoport eltávolítása és semlegesítés után lépésről-lépésre építjük fel a gyantán. A védőcsoportok eltávolítását a semlegesítést és az egyes aminosavak beadagolását általában a Guillemin és munkatársai által részletesen leírt eljárással végezzük (3.904.594. sz. amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás). A kapcsolásokat részletesebben ismertetve a következő munkaterv szerint vébezzük el. MUNKATERV Lépés Reagensek és műveletek keverési száma idő, perc 1. Mosás CH2Cl2-vel (kétszer) 0,5 2. 50% trifluor-ecetsav(TFA) + + 5% 1,2-etán-ditiol CH2Cl2-ben egyszer) 0,5 3. 50% trifluor-ecetsav (TFA) + 5% 1,2-etán-ditiol CH2Cl2-ben (egyszer) 20,0 4. Mosás CH2Cl2-vel (háromszor) 0,5 5. Mosás CH3OH-val (kétszer) 0,5 6. Semlegesítés 10% trietil-aminnal (Et3N) CH2Cl2-ben (kétszer) 0,5 7. Mosás CH3OH-val (kétszer) 0,5 8. Semlegesítés 10% trietil-aminnal (Et3N) CH2Cl2-ben (kétszer) 0,5 9. Mosás CH3OH-val (kétszer) 0,5 10. Mosás CH2Cl-vel (kétszer) 0,5 11. ’BOC-aminosav (1 mmól/g gyanta) + ekvivalens menynyiségű diciklohexil-karbodiimid (DCC) CH2C12-ben 120,0 12. Mosás CH2Cl2-vel (egyszer) 0,5 13. Mosás 50% dimetil-formamiddal CH2Cl2-ben (egyszer) 0,5 14. Mosás 10% trietil-aminnal CH2Cl2-ben (egyszer) 0,5 15. Mosás CH3OH-val (kétszer) 0,5 16. Mosás CH2Cl2-vel (kétszer) 0,5 17. 25% ecetsavanhidrid CH2Cl2-ben (2 ml/g gyanta) 20,0 18. Mosás CH2Cl2-vel (kétszer) 0,5 19. Mosás CH3OH-val (kétszer) 0,5 *Az Asn és Gin kapcsolásához 1-hidroxi-benzotriazolt (HODT) vezetünk be ebbe a lépésbe, 1,136-szoros moláris feleslegben Röviden a kapcsolási reakcióhoz egy mmól BOC-al védett aminosavat használunk metilénkloridban lí g gyantához, és még egy mól ekvivalens 0,5 mólos Dl-ből metilén-kloridban vagy olyan keverékben, amely 30% DMF-et tartalmaz metilén-kloridban, a kapcsolási reakciót két órán ál folytatjuk. Amikor Arg-t kapcsolunk, olyan keveréket használunk, amely 10% DMF-ot tartalmaz metilén-kloridban. Benzil csoportot használunk hidroxil oldalláncot védő csoportként Ser-hez és Thr-hoz. 2-klór-benzil-oxi-karbonil (2 Cl-Z) csoportot alkalmazunk védőcsoportként a Lys oldalláncához. Tos-t használunk az Arg guanidinocsoportjának védéséhez, és a Glu vagy Asp karboxil-csoportját benzil-észterként védjük. A Tyr fenolos hidroxil csoportját 2,6-diklór-benzil csoporttal védjük. A szintézis végén a következő kompozícióhoz jutunk: X1- -Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-IIe-Phe-Thr(X4)-Asn-Ser(X5)-Tyr(X2)-Agr(X6)-Lys(X7)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X3)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln-Asp(X3)-Ele-Met-Ser(X5)-Arg(X6)-Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-Ser(X5)Asn-Gln-Glu(X3)-Arg(X6)-Gly-Ala-Arg(X6)-Ala-arg(X6)-Leu-X8 9 10, ahol X3 jelentése BOC, X2 jelentése 2,6-diklór-benzil, X3 jelentése benzil-észter, X4 jelentése Bzl, X5 jelentése Bzl, X6 jelentése Tos, X7 jelentése 2C1-Z és X8 jelentése -0-CH2-benzol-polisztirol támasztó gyanta. Miután a befejező Tyr gyököt hozzákapcsoltuk a gyantához, a BOC csoportot eltávolítjuk 45% TFA-val CH2Cl2-ben. A védőcsoportok lehasítása és a pepiidnek a gyantáról történő lehasítása érdekében 1 g peptid-gyanta komplexumra számítva 1,5 ml anizolból, 0,26 ml metil-etilszulfidból és 10 ml hidrogén-fluoridból (HF) álló keveréket használunk, a kezelést — 20 *C hő-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
