198952. lajstromszámú szabadalom • Eljárás emlős agyalapi mirígy eredetű növekedési hormon kibocsátást elősegítő faktor (PGRF) előállítására
1 HU 198952 B 2 láncot védő csoport legyen eltávolítható a szintézis teljessé tétele után (vagyis amikor a kívánt aminosav-szekvencia kialakult) olyan körülmények között, amelyek nem változtatják meg a peptid-láncot. A peplideket előnyösen szilárd fázisú szintézissel készítjük, ahogyan ezt Merrifield leírta [J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963)]. A szilárd fázisú szintézis a pepiid C-terminális végéről kezdődik egy védett a-aminosav kapcsolásával a megfelelő gyantához. Ilyen kiindulási anyagot lehet készíteni az aminocsoporton védett Leu vagy Alá kapcsolásával egy észter-kötés útján egy klórmetilezett gyantához vagy egy hidroxi-metil gyantához, vagy egy amid-kötés útján BHA vagy MBHA gyantához. A hidroxi-metil gyanta készítését Bodansky és munkatársai írták le [Chem. Ind (london) 38, 1597-98 (1966)]. A klór-metilezett kereskedelmi forgalomban hozzáférhetők, a Bio-Rad Laboratories, Richmond, California vagy a Láb. Systems, Inc. cégek termékei. Az ilyen gyanták készítését Stewart és munkatársai írták le ["Solid Phase Peptide Synthesis" (Szilárd fázisú peptid szintézis), Freeman and Co. kiadása, San Francisco, 1969, 1. fejezet, 1 — 6. oldal]. A BHA és MBHA hordozó gyanták kereskedelmi forgalomban kaphatók, és általában akkor használatosak, amikor a szintetizálandó polipeptid-karboxamid csoporttal rendelkezik a C-terminálison. A BOC-al védett Ala a klór-metilezett gyantához Monahan és Gilon módszere szerint kapcsolható (Biopolymer, 12, 2513—19, 1973), amikor pl. 40 aminosavból álló pepiidet kell előállítani. A BOC-Ala gyantákhoz történő kapcsolását követően az a-aminocsoportot védő csoportot eltávolítjuk metilén-kloridos közegben trifluor-ecetsawal (TFA), vagy csak TFA-val, vagy dioxános közegben sósavval. A védőcsoport eltávolítását 0 °C és szobahőmérséklet között kell végrehajtani. Egyéb szokásos hasító reagensek és körülmények is használhatók az egyes a-aminocsoportokat védő csoportok eltávolítására, amint ezeket Schröder és Lubke leírták [The Peptides, 1, 72 — 75 (Academic Press 1965)]. Az Alá a-aminocsoportját védő csoport eltávolítása után a többi u-aminocsoportban és oldalláncban védett csoporttal rendelkező aminosavat lépésenként kapcsoljuk össze a kívánt sorrendben; az egyes aminosavak egyenkénti adagolásának alternatívájaként alkalmazhatunk olyan módszert is, amelyben néhány aminosavat egymáshoz kapcsolunk még a szilárd fázisú reaktorba történő adagolás előtt. A megfelelő kapcsolódó reagens kiválasztása a szakterületben jártassághoz tartozik. Különösen alkalmas kapcsolódó reagens az N, N^diciklohexil-karbodiimid (DCC). A peptidek szilárd fázisú szintézisében alkalmazott aktiváló reagensek jól ismertek a peptidkészítés gyakorlatában. A megfelelő aktiváló reagensekre a következő példák adhatók; (1) karboxiimidek, mint pl. N,N’-diizopropil-karbodiiraid, N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid; (2) ciánamidok, mint pl. N,N’-dibenzil-ciánamid; (3) ketiminek; (4) izoxazólium sók, mint pl. N-etií-5-fenil-izoxazólium-3’-szulfonát; (5) aromás jellegű monociklusos, nitrogén-tartalmú heterociklusos amidok, 1 — 4 nitrogénnel a gyűrűben, mint pl. imidazolidok, pirazolidok és 1,2,4-triazolidok. Jellegzetes heterociklusos amidok, amelyek itt használatosak, az N,N’-karbonil-diimidazol és az N,N’-karbonil-di-l,2,4-triazol; (6) alkoxilezett acetilének, mint pl. etoxi-acetilén; (7) olyan reagensek, amelyek vegyes anhidridet képeznek az aminosav karboxilcsoportjával, mint pl. etil-kloroformát és izobutil-kloroformát; és (8) olyan reagensek, amelyek aktív észtert képeznek az aminosav karboxilcsoportjával, ilyenek pl. az olyan nitrogén-tartalmú heterociklusos vegyületek, amelyek egy gyűrű-nitrogénen hidroxilcsoporttal rendelkeznek, mint az N-hidroxi-ftalimid, N-hidroxi-szukcinimid és 1- -hidroxi-benzotriazol (HOBT). Más aktiváló reagenseket és alkalmazásukat a kapcsolási reakciókban is leírták Schröder és Lubke a korábban idézet mű III. fejezetében, valamint Kapoor a J. Pharm. Sei. 59, 1 — 27 (1970) irodalmi helyen. Minden védett aminosavat vagy aminosavszekvenciát kétszeres vagy nagyobb fölöslegben adagolunk a szilárd fázisú reaktorba, és a kapcsolást dimetil-formamid (DMF):CH2d2 (1:1) közegben hajthatjuk végre, vagy csak DMF-ben, ill. csak CH2Cl2-ben. Abban az esetben, ha a kapcsolás nem megy végbe tökéletesen, a kapcsolási eljárást még egyszer el keli végezni az aaminocsoportot védő csoport eltávolítása előtt, amely megelőzi a következő aminosav kapcsolását. A kapcsolási reakció sikerét a szintézis minden stádiumában ninhidrin reakcióval kell ellenőrizni, ahogyan ezt E. Kaiser és munkatársai [Anal. Biochem. 34, 595 (1970)]. Miután a kívánt aminosav-szekvencia teljessé vált, a köztes peptidet el kell távolítani a gyantáról, pl. folyékony hidrogén-fluoriddal, amely nem csupán lehasítja a peptidet a gyantáról, hanem lehasítja az összes megmaradt, oldalláncot védő X2, X3, X4, X5, X6, X“ és X8 csoportot és az a-aminocsoportot védő X1 csoportot, így a pepiidhez jutunk. Alternatív módszerként a védőcsoportokat tartalmazó terméket is el lehet különíteni a gyantáról alkoholízissel, majd a C-terminálison nyert alkil-épsztert hidrolízissel savvá lehet átalakítani. Bármelyik oldalláncot védő csoportot le lehet ez után hasítani a korábban leírt módszerek szerint vagy bármely más ismert módszerrel, pl. katalitikus redukcióval (pl. Pd báriumszulfáton). Amikor a hasításhoz hidrogén-fluoridot használunk, anizolt és metil-etil-szulfidot is adunk a reakcióedénybe öblítés céljából. A következő példákban bemutatjuk a PGRF szintézisét szilárd fázisú technikával. A rövidebb peptid fragmensek szintézisét azonos módszerrel hajtjuk végre, csupán elhagyjuk a kívánt mennyiségű aminosavat a lánc valamelyik végénél, azt azonban tudni kell, hogy a biológiailag 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
