198796. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anioncserélő hordozólapok előállítására és szilárdfázisú eljárás és berendezés nukleinsavfragvensek szekvenciájának megállapítására
If) HU 198796 B 16 eddigiekben leirtakoz hasonlóan történnek. A reakciók befejezése után a piperidin oldatokat az élűéit fragmensekkel egyhe túlnyomás alkalmazáséval átjuttatjuk a reaktorokkal teflon-csövecskékkel összeköttetésben lévő Eppendorf-kupakokba és végül liofilizáljuk. 17. példa Szekventálás a nukleinsav-fragmenseknek a hordozóból történő eluéléséhoz nagjr_ ionerősségű vegyüleiek alkalmazásával A leirt hordozó lapok alkalmazásával a fragmensek eluélása a piperidin-reakció előtt is történhet 1-2 mólos sóoldatok, például NH4HCO3-, (NH4)zC03-, NH400CCH3-, (C2Hs)3NHOOCCH3-oldatok felhasználásával. Az elúciót úgy végezzük, hogy a hordozó lapokat külön-külön reaktor edényben (például Eppendorf-kupakokban) 2 x 50 pl sóoldattal kezeljük 60 °C hőmérsékleten. Oligonukleotidok esetében az eluátumokat liofilizáljuk, amikor is a sók a vizes etanollal megismételt liofilizálások során eltávo- IIUtalók. A hosszabb DNS-fragmensek esetében a sókat etanolos kicsapatással távolíthatjuk el. Ezután a szokásos piperidin-reakció következhet homogén fázisban. 18. példa A szilárdfézisú szekventálás kivitelezésére szolgáló berendezés alapösszeállítása 5 darab 1 szekventáló tömbből, 4 darab 2 fedélből, egy 3 mintaadagolóból, egy 5 szétvágó egységből és 4 darab 4 hordozólap tartóból áll. A 21 szekventáló tömb egy négyzetalakú 1.1 alaptömbból és az abban elhelyezett 1.2 reaktor edényekből áll. A 2 fedél pontosan illeszkedik az 1 szekventáló tömbre, és áll egy 2.1 merev lapra rögzített 2.2 rugalmas tömítésből, amelyen az 1.2 reaktor edények számának megfelelő dugószerű 2.4 kiemelkedés van. A 2.3 fedélrögzitő elemek a sarkokon helyezkednek el. Erre a célra általában 2 darab szorítócsavart alkalmazunk, amelyek a tömbben lévő menetes furatokba csavarhatok. A 4 hordozó lap tartó áll egy 4.1 alaplapból, amelyen egy megfelelő 4.2 mélyedés van, továbbá egy 4.3 vezető lapból és egy 4.5 rögzítő elemből. Az 1.2 reaktor edények számának és elhelyezkedésének megfelelően a 4.3 vezető lapon és a 4.1 alaplapon 4.4 furatok vannak, amelyek lehetővé teszik az 5.2 szétvágó rudacskák és a 3.2 kapillárisok bevezetését. A 4.4 furatok átmérője kisebb, mint az 1.2 reaktor edények belső átmérője. A minta adagoló egy 3.1 kapilláris tartóból és a 3.2 kapillárisokból áll. A 3.1 kapilláris tartó - egy négyzetalakú lap, amelynek felülete megfelel az 1 szekventáló tömb felületének - furatainak száma és elrendezése szintén megfelel az 1 szekventáló tömbben lévő 1.2 reaktor edények számának és elrendezésének. A furatokban a 3.2 kapillárisok elmozdíthatóan helyezkednek el, de a kapillárisok 3.3 csúcsai egy síkban vannak és a 3.3 csúcsok, valamint a 3.1 kapilláris tartó közötti távolság legalább akkora, mint az 1.2 reaktor edények mélysége. A 3.2 kapillárisok külső átmérője valamivel kisebb, mint a 4 hordozó lap tartó 4.4 furatainak átmérője. Az 5 szétvágó egység szintén négyzet alakú, mint az 1 szekventáló tömb, és egy 5.1 nyomólapból és a laphoz rögzített 5.2 szétvágó rudacskákból áll. Az 5.2 rudacskák száma és elhelyezkedése megfelel a 4 hordozó lap tartó 4.4 furatai számának és elhelyezkedésének. Az 5.2 rudacskák pontosan illeszkednek a 4.4 furatokba, és hosszúságuk legalább akkora, mint a 4.1 alaplap és a 4.3 vezető lap együttes vastagsága. A szilárd fázisú szekventálás végrehajtásához a vizsgálandó mintákat az egyik 1 szekventáló tömb 1.2 reaktor edényeibe töltjük. A 3 minta adagoló segítségével a kapillárisokat bementjük a vizes oldatokba és a kapilláris erő hatása alapján a kapillárisok egyenletesen feltöltődnek (2.a. ábra). Ezután a 3 minta adagolót rányomjuk a nedvszívó 4.6 hordozó lapra, amely elmozdulásmentesen a 4.1 alaplap 4.2 mélyedésében fekszik. így a folyékony mintákat fel tudjuk vinni a 4.6 hordozó lapra, amelyben olyan mintaeloszlás jön létre, ami megfelel az 1.2 reaktor edények elhelyezkedésének. Az 1.2 reaktor edények, illetve a felvitt minták közötti távolságot úgy választottuk meg, hogy a minták átfedése ne következzen be (l.a ábra). Azonos műveleteket végzünk el további három 4.6 hordozó lappal, de az átitatások számát változtatjuk, mivel a különböző modifikációs reakciókhoz különböző mintamennyiséget tartalmazó hordozó lapok szükségesek. A 4 darab átitatott 4.6 hordozó lapot a korábbiakban leirt modifikációs reakcióknak vetjük alá. Ezután ismét visszahelyezzük azokat a 4 hordozó lap tartókba, mégpedig pontosan a tartókban kiképzett 4.2 mélyedésbe. Az 5 szétvágó egység 5.2 szétvágó rudacskáit beillesztjük a 4.4 furatokba, és lenyomva a 4.6 hordozó lap mintákat tartalmazó részeit az 1.2 reaktor edényekbe szétvágjuk (3. ábra). Azonosan járunk el a további három átitatott 4.6 hordozó lapnál is, így végül a négy 1 szekventáló tömbben a megkötött minták az 1.2 reaktor edényekbe kerülnek. Ezután az eljárás szerint előirt mennyiségű piperidin oldatot adunk az összes szekventáló tömb reaktor edényeibe, a 2 fedeleket fölhelyezzük és az összes egyidejűleg 90 °C hőmérsékleten hőkezeljük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 00 65 10
