198796. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anioncserélő hordozólapok előállítására és szilárdfázisú eljárás és berendezés nukleinsavfragvensek szekvenciájának megállapítására
13 HU 198796 B 1-1 Hosszú DNS-szekvenciák manuális szekventáíása reagens-fölösleggel reaktor edényben A hosszú DNS-szekvenciákat a 11., 12. és 13. példában leírtakhoz teljesen hasonlóan szekventáljuk, viszont a 11. példa 3. pontjában felsorolt modifikációs reakciókidejét csökkenteni kell a kővetkezők szerint: a G-reakció ideje 3-5 perc, a többi reakció ideje 10 perc legyen. A radioaktivitás vesztesége a modifikációs reakciók során lényegesen kisebb a hosszú DNS-fraginenseknél. 14. példa 15. példa DNS-szekvenciák manuális szekventálása reagens-fölösleg nélkül A DNS-szekvenciák megjelölése és megkötése a 11. példa 1. és 2. pontjában illetve a 13. példában leirtak szerint történik. A hordozó lapokat jelen esetben nem reaktor edénybe (például Eppendorf-kupakba), hanem egy műanyag fóliával borított sik alátétre helyezzük, és a 11. példa 3. pontjában felsorolt modifikációs reagensekkel éppen csak átnedvesítjük a papírdarabkákat. A 2x2 mm-es papír darabkákhoz általában kb. 1-3 /ul reagens szükséges. A nagyobb hordozó-lapokhoz, például a 2 x 20 mm nagyságúakhoz a reagens mennyiségét megfelelően növelni kell. Minden más műveletet: a modifikációs reakciókat, a mosást, a piperidin-reakciót az eddigiekben leírtak szerint végezzük. 16. példa Az eljárás automatikus módszere A DNS/RNS-szekventáló automata készülék felépítését a következőkben írjuk le. A legegyszerűbb esetben, csak egy nukleinsavfragmens szekventálására a készülék 4 db egymás mellé elhelyezett, Lermosztálható, üvegszűrövei és adagoló, valamint leeresztő csonkkal ellátott, max. 250 /ul térfogatú reaktorból áll. A megkötöLL és radioaktív jelzéssel ellátott riukleinsavfragmenset tartalmazó 4 db különálló, 2x2 mm nagyságú hordozó lapot a reaktorokba helyezzük. Ezután következik egy előre beállított program szerint a műveletek -1. ) mosás, 2. ) kémiai modifikációs reakciók, 3. ) mosás, 4. ) piperidin reakció (elúció) - automatikus elvégzése. A 11. példa 3. pontjában felsorolt reagenseket adagoló szivattyú juttatja a reaktorokba, ahol azok meghatározott ideig tartózkodnak, amíg a leereszLő szelepek zárt állásban vannak. A reakció befejezése után a leeresztő szelepek nyitnak és a leürítést csekély túlnyomás alkalmazásával segítjük elő. A vizes és etanolos mosás lépései történhetnek folyamatosan (ha a leeresztő szelep nyitott és felváltva vezetjük a reaktorba a vizet és az etanolt), vagy szakaszosan (100 /ul vizet vagy etanolt adagolva és rövid tartózkodási idő után leeresztve). A szakaszos mosás lépései között és 7 ó után vagy a folyamatos mosás végén a hordozókat szükség szerint, néhány másodpercig meleg levegővel száríthatjuk. A piperidin reakcióhoz a 4 db reaktorba kb. 25 - 50 /ul 10%-os vizes piperidin oldatot szivattyúzunk (a. leeresztő szelepek zárt állásban) és a reaktorokat 30 percig 90 “C hőmérsékleten tartjuk. A leeresztő szelepek nyitása után a piperidin oldatokat 4 db Eppendorf-kupakba juttatjuk csekély túlnyomás alkalmazásával (a kupakok a reaktorokkal 0 0,4 - 1 nirn-es tefloncsövecskékkel vannak összeköttetésben). Az eluált fragmenseket tartalmazó 4 db Eppendorf-kupakot vagy közvetlenül az automata készüléken belül egy speciális vákuumkamrában liofilizáljuk, vagy a liofilizálás a rendszeren kívül történik. Az első esetben az első liofilizálás után a műveletet automatikusan adagolt 10 -- 20 /ul víz hozzáadásával! kétszer - háromszor megismételjük. A teljes műveleti idő kb. 2,5 óra. A második esetben, a manuális liofilizálás esetén a teljes idő kb. 20 - 30 perc. A minták az előző műveletek után elkészültek a gélelektroforézis alkalmazásához. Bonyolultabb esetben, több DNA-I'ragmens szekventálásához a 4 db reaktor méretének nagyobbnak kell lennie. A reaktorok alapfelülete 8 -- 15 szekventálandó fragmens esetén 0,5 x 6 cm. A 4 db nagyobb, 0,4 x 5,5 cm-es hordozó lapot a felvitt 8-15 fragmenssel a reaktorokba helyezzük és az 1) és 2) számú műve-' letet magától értetődően nagyobb mennyiségű reagensekkel elvégezzük. A modifikációs reagensek leeresztése után következik a mosás (a 3.) számú művelet). Ez;után a megszéritott hordozó lapokat automatizálható műszaki megoldással különálló, kisebb darabpkr.a vágjuk és egyidejűleg mindegyik kis darabot külön-külön egy-egy üvegszűrővel és leeresztő szeleppel ellátott piperidin reaktorba (kb. 50 reaktor szükséges) helyezzük. A legjobb megoldás erre az, ha 4 db mozgatható modifikációs reaktort alkalmazunk, amelyek a 3 ) számú művelet után a vízszintes tengelyük körül 180 “-kai megfordulnak és a fedelük kinyílik. A hordozó lapok Így 4 db mozgó (függőlegesen elmozduló) vágó berendezésbe jutnak. A 4 db függőlegesen elmozdítható vágó berendezésben a hordozó lapok kisebb darabokra történő vágásával a minimálisan 4 x 8 = 32 db illetve maximálisan 4 x 15 = 45 db piperidin-reaktorba juttatunk egy-egy fragmenset. A x>iperidinreakciók az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
