198741. lajstromszámú szabadalom • Eljárás citorodin S származékok, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
13 HU 198741 B 14 A származék tömegszámát FAB/MS spektrométerrel (JMS-DX300) mértük, 1071 (M+H*) tömegspektrumot kaptunk, amely a számítottnak felel meg. A származék abszorpciós spektruma megtartotta a citorodin S antraciklin gyűrűjére jellemző specifikus abszorpciót 495 nm-nél. 7. példa 5 mg citorodin S 1 ml metanollal készült oldatához hozzáadtuk 1,7 mg amino-etán-tiol 1 mg/ml-es metanolos oldatát, amey megfelel a citorodin S 6 mólé g yenérté kének, és 1,4 mg nátrium-ciano-bór-hidridet, amely 3 mólegyenértéknek felel meg. A reakcióelegyet 25 °C-on 24 óra hosszat reagáltattuk. A kapott reakcióelegyet, miután TLC-vel ellenőriztük a termék jelenlétét, HPLC-vel vizsgáltuk tisztaságra, és tisztítottuk. Az amino-etán-tiol-származék Rf értéke a TLC-ben, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában 0,25. Az amino-etán-tiol-származék retenciós ideje a HPLC-ben, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, 28 perc. A HPLC-vel végzett tisztítás, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, mintegy 1,6 mg amino-etán-tiol-szérmazékot eredményezett. Az említett származék tömegszáma FAB/MS spektrométerrel (JMS-DX300) mérve 1002 (M+H*) értéket adott, amely megegyezett a számítottal. Az említett származék abszorpciós spektruma jól megtartotta a citorodin S antraciklin gyűrűjére jellemző 495 nm körüli specifikus abszorpciót. Másrészt az -SH csoportok bevezetését N-etil-maleimiddel végzett reakció után a TLC és HPLC foltok és csúcsok megváltozása igazolta (az amino-etán-tiol-származéknál megfigyelt változások nem jelentkeztek a citorodin S.-nél és amino-citorodin S-nél). 8. példa 5 mg citorodin Sím] metanollal készült oldatához hozzáadtuk 2,7 mg cisztein 1 mg/ml-es metanolos oldatát, amely megfelel a citorodin S 6 mólegyenértékének, és 1,4 mg nátrium-ciano-bór-hidridet, amely megfelel 3 mólegyenértékének. A reakcióelegyet 25 °C-on 24 óra hosszat reagáltattuk. Az így kapott reakcióelegyet, miután TLC-vel ellenőriztük a termék jelenlétét, HPLC-vel tisztaságra vizsgáltuk, és tisztítottuk. A cisztein-származék Rf értéke a TLC-ben, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, 0,35. A cisztein-származék retenciós ideje a HPLC elemzésben ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, 32 perc. A HPLC-vel végzett tisztítás, amelyet ugyanolyan körülmények között végeztünk, mint a 2. példában, kb. 1,8 mg cisztein-származékot eredményezett. Az említett származék tömegszáma FAB/MS spektrométerrel (Nihon Denshi gyártmány) mérve 1046 (M+H*) értéket adott, amely megfelel a számítottnak. Az -SH csoport bevezetését a 7. példában ismertetett módon igazoltuk, vagyis az N-etil-maleimiddel végzett reakció után a TLC és HPLC foltok és csúcsok helye megváltozott. 9. példa 11 mg nyúl immunoglobulin (Sigma gyártmány) 1 ml 1 mmól/1 EDTA-tartalmú 50 mmól/l-es foszfát-puffer-oldattal (pH=7,5) lészült oldatához hozzáadtuk 191 pg N-^-maleiinido-butiril-oxi-szukcinimid (Behring Diagnostics gyártmány, a továbbiakban GMBS) 50 mg/ml-es DMF-es oldatét. A reakcióelegyet 25 °C-on 2 óra hosszat reagáltattuk. Ezután a reakcióelegyhez hozzáadtunk 50 jul 1 mól/1- -es Lrisz-hidroklorid puffer-oldatot (pH=7,8), és az elegyet 25 °C-on 5 percig állni hagytuk. A reakcióelegyet ezután PD-10 oszlopon (Pharmacia gyártmány) frakcionéltuk, az oszlopot előzőleg 1 mmól/1 EDTA-tartalmú 50 mmól/l-es foszfát-puffer-oldattal (pH=7,5) kiegyensúlyoztuk, így bevezetett maleimidocsoportokat tartalmazó nyúl immunoglobulint kaptunk. A 7. példában előállított, bevezetett -SH csoportokat tartalmazó citorodin S származékot reagáltattuk a bevezetett maleimidocsoportokat tartalmazó nyúl immunoglobulinnal. 1,5 mg citorodin S amino-etán-tiol származék 100 mg/ml-es DMF-es oldatát, amely megfelel a maleimidocsoportokat tartalmazó nyúl immunoglobulin 2 mólegyenértékének, hozzáadtuk a fenti módon előállított, maleimidocsoportot tartalmazó nyúl immunoglobulinhoz. A reakcióelegyet 5 °C-on 12 óra hosszat reagáltattuk. A kapott komplex megfelel az (3) általános képletnek, ahol X jelentése (f) képletű csoport, n értéke 12. 10. példa 5 mg citorodin S 1 ml metanollal készült oldatához hozzáadtuk 3,2 mg glicin-etil-észter 1 mg/ml-es metanolos oldatát, amely megfelel a citoi'odin S 6 mólegyenértékének, és 1.4 mg nátrium-ciano-bór-hidridet, amely megfelel 3 mólegyenértéknek. Az elegyet 25 °C-on 24 óra hosszat reagáltattuk. Az így kapott reakcióelegyet, miután TLC-vel igazoltuk a termék jelenlétét, HPLC-vel tisztaságra vizsgáltuk, és tisztítottuk. A glicin-etil-észter-származék Rf értéke a TLC-ben, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában 0,34. A glicin-etil-észter-származék retenciós 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
