198741. lajstromszámú szabadalom • Eljárás citorodin S származékok, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
15 HU 198741 B 16 ideje a HPLC-ben, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, 32 és 33 perc. A HPLC-vel végzett tisztítás, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, kb. 1,4 mg glicin-etil-észter-származékot erednie- 5 nyezett. Az említett származék tömegszáma FAB/MS spektrométerrel (JMS-DX300) mérve 1028 (M+H*) értéket adott, amely megfelel a számítottnak. 1° A származék abszorpciós spektruma jól megtartotta a citorodin S antraciklin gyűrűjére jellemző, 495 nm-nél megjelenő abszorpcióját. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott citorodin S és előállított termékek kromatográfiás vizsgálati eredményei 20 1. Vizsgálat 254 nm-nél Oszlop: Senshu-Pak, reverz fázis ODS oszlop, 4,6x250 mm. Mobil fázis: A oldószer: acetonitril B oldószer: 2,0% trietil-ammónium-foszfát, pH=3,0 Gradiens: Idő A oldó- B oldószer (%) szer (%) 0.0 perc 30.0 perc 40.0 perc Átfolyási arány: 1,0 0.0 100 30.0 70.0 30.0 70.0 ml/perc 25 30 2. Vizsgálat 254 nm-nél Oszlop: Brown Lee Spheri 5 RP-18, 4,6x100 mm. Mobil fázis: A oldószer: acetonitril B oldószer: 2,0% trietil-ammónium-foszfát, pH=3,0 Gradiens: Idő A oldó- B oldószer (%) szer (%) 0.0 perc 30.0 perc 40.0 perc Átfolyási arány: 1,5 0.0 100 30.0 70.0 30.0 70.0 ml/perc. 35 40 45 3. Vizsgálat 280 nm-nél Oszlop: Toyosoda gél G 3000SW, 7,5x600 mm Mobil fázis: 20 mmól/1 foszfát, 200 mmól/1 NaCl, pH=7,0 Átfolyási arány: 0,5 ml/perc. Eredmények Vegyület Retenciós idő (perc) 1. vizsg. 2. vizsg. 3. vizsg. 55 Citorodin S 36.8 26.5 47.9 Amino-citorodin S 28.0 21.5 47.9 GMBS-38.0 28.0 47.9 60-Amino-citorodin S 38.7 29.0 47.9 Nyúl IgG-. 0.97 30.2 Nyúl IgG konjugátum 28.6 22.5 47.9 65 Eredmények Vegyület Retenciós idő (perc) 1. vizsg. 2. vizsg. 3. vizsg. 3. példa, n=12) MA208 (mo- - 0.97 32.2 noklonális antitest CEA ellen) MA208 kon- - 0.97 32.2 jugátum (n=12) Mivel az amino- és a GMBS-amino-citorodin S két diasztereoizomert tartalmaz, két retenciós idő jelentkezik. Az 5. és 9. példa szerint előállított nyúl IgG konjugátum retenciós ideje megegyezik a 3. példa szerint előállítottéval, illetve a hibahatáron belüli eltérés mutatkozik. Az MA208 és MA208 konjugátum előállítását a 11. példa szerinti módon végeztük. 11. példa Nőstény, 7-10 hetes BALB/C egereknek intraperitoneálisan adagoltunk 25 pg tisztított humán CEA-t komplett Freund-féle adjuvánssal együtt. 10 hét után intravénásán adagoltunk 25 pg CEA-t fiziológiás sóoldatban. Az adagolás utáni 3. napon eltóvolitottuk az állatok lépét, a lépsejteket fuzionáltuk nem-termelő típusú mieloma X63-Ag 8653 sejtekkel. A sejtfúziót és a tenyésztést Oi és munkatársai módszerével végeztük (Oi, V. T. és Herzenberg, L. A., Selected Methods ín Cellular Immunology, B. B. Mishell and S. M. Shiigi kiadó, 351. oldal, Freeman and Co., San Francisco, 1980). A lépsejtek és mielomasejtek aránya 10:1 volt. Az elegyet rövid centrifugálással ülepítettük. Az üledékhez cseppenként hozzáadtunk 0,5 ml 42,5%-os polietilén-glikolt (móltömeg 2000, 15% dimetil-szulfoxidot tartalmazott), és az elegyet lassan kevertük 37 °C-on 2 percig. A kapott elegyet 20:1 arányban hígítottuk RPMI tépközeggel. Centrifugálás után szarvasmarha embriószérumot tartalmazó RPMI-1640 tépközegben szuszpendáltuk. A szuszpenzíót lyukanként 5xl05 sejt mennyiségben egy 96 lyukú míkrotiter lemezre vittük. 37 °C-on egy éjszakán át végzett tenyésztés után mindegyik lyukba egy csepp HAT-tápközeget juttattunk (100 pmól/1 hipoxantin, 4x10*^ pmól/1 aminopterin, l,6xl0'2 timidin). A hibridoma sejtek szelektálását a HAT tápközeggel úgy végeztük, hogy a 2., 3,, 5., 7., 10. és 13. napon kicseréltük minden lyukban a tápközeg felét friss HAT tápközeggel, A tenyészetek felülúszójénak anti-CEA aktivitását RIA és EIA módszerrel mértük. Az aktívnak talált sejteket nagyobb tenyésztő rendszerbe 10
