198734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rezofurin szk-ok glikozidjainak előállítására, eljárás glikozidázok és szacharid láncokat hasító enzimek aktivitásának meghatározására és diagnosztikumok enzimek kimutatására
1 HU 198734 B 2 ranozidot, vékonyréteg-kromalográfia (futtatószer: lásd a 7.példában) Rf * 0,71; továbbá 0,4 g, tét raacctil-rezorufi n-4-karbonsav-morfolid-ff-D-galakiopiranozidot kapunk. Vékonyréteg-kromalográfia (ugyanazzal a futtatószerrel), Rf «= 0,76. A fentieken kívül még 1,2 g kevert frakciót is kapunk, amely a két izomerből áll. 10. példa Rezorufin-l-karbonsav-metil-észter-/?-D-galaktopiranozid 1,2 g tetraacetil-rezorufin-9-karbonsav-metil-észter-/?-D-galaktopiranozidot a 2. példában leírtakkal analóg módon nátrium-metiláttal/metanollal dezacetilezünk. A kitermelés: 0,8 g. UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH = 7,5): Xq,ax = 646 nm (t = 21,8 cm2 mól'1). /1-galaktozidázzal végzett hasítás után megkapjuk a rezorufin-l-karbonsav-metil-észter anioniát. Amax = 572 nm (é = 65,4 cm2 mól'1). ‘H-NMR (DMSO-d6): í= 3,20-3,80 (m, 6H); 3,91 (s, 3H); 5,09 (d, J = 7,5Hz, 1H); 6,30 (d, J = 2,1 Hz, 1H); 6,81 (dd, J = 9,8 és 2,1Hz, 1H); 7,30 (m, 2H); 7,51 (d, J = 9,8Hz, 1H); OH- protonok, nagyon széles, 5 ppm-nél. A megfelelő tetraacetátok analóg módon végzett dezacetilezésével még az alábbi vegyüleleket állítjuk elő: a) rezorufin-1 -karbonsav-metil-észter-/)-D- galaktopiranozid, lH-NMR (DMSO-d6): 6-3,4-3,7 (m, 6H); 5,09 (d, J = 7,5Hz, 1H); 6,34 (d, J = 2Hz, 1H); 6,97 (d, J=2Hz, 1H); 7,08- -7,17 (m, 2H); 7,75 (d, J = 10Hz, 1H); OH: nagyon széles, 5 ppm-nél; b) rezorufin-6-karbonsav-morfolid-/?-D-galaktopiranozid, 'H-NMR (DMSO-d6): s= 3,35- -3,90 (m, 14H); 5,04 (d, J=8Hz, 1H); 6,81 (d, J = 10Hz, 1H); 7,14 (dd, J=9,0 és 2,2Hz, 1H); 7,16 (d, J = 2,2Hz, 1H); 7,56 (d, J = 10Hz, 1H); 7.80 (d, J = 9,0Hz, 1H); OH: 4,5 és 5,2 ppm között, 4H, Rf= 0,3, élil-acetát — izopropanol - víz (9:4:2) futtatószerrel, /J-galaktozidázzal végzett hasítás után: UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfátpuffer, pH = 7,5): Amax = 593 nm; Fluoreszcencia-emisszió: X max = 593 nm; c) rezorufin-4-karbonsav-morfolid-/?-D-galaktopiranozid, ‘H-NMR: í = 3,2-3,85 (m, 14H); az aromás protonok tartományában 2 rotációs izomer válik láthatóvá (a karbonsav-morfolidcsoportnak a rezorufin gyűrűrendszerhez viszonyított helyzete alapján). Ezek viszonya kb. 6:4. I. izomer: 5,03 (d, J = 8Hz, 1H); 6,23 (d, J = 2,2Hz, 1H); 6,770 (dd, J =10 és 22Hz, 1H); 7,23 (d, J-9,0Hz, 1H); 7,51 (d, J = 10Hz, 1H); 7.81 (d, J = 10Hz, 1H). 11. izomer: 5,05 (d, J=8Hz, 1H); 6,25 (d, J - 2,2Hz, 1H); 6,775 (dd, J = 10 és 2,2Hz, 1H); 7,27 (d, J = 9,0Hz, 1H); 7,551 (d, J - 10Hz, 1H); 7,83 (d, J = 10Hz, 1H). Rf= 0,3 (etil-acetál- izopropanol - víz (9:4:2) futtatószerrel, /?-galaktozidázzal végzett hasítás után: UF/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH- 7,5): Amax = 453 nm, fluoreszcencia emisszió: AmjU = 593 nm. 11. példa Rezorufin-9-karbonsav-g-D-galaktopiranozid-trietil-ammóniumsó 266 mg rezorufin-9-karbonsav-metil-észter-/3- -D-galaktopiranozidot felveszünk 50 ml víz és 20 ml 1,4-dioxán elegyével. Ehhez 0,5 ml-es részletekben összesen 5 ml 0,1 n nátrium-hidroxid-oldatot adunk, emellett az oldat pH-értéke nem lehet 12,5-nél magasabb. Ezután a reakcióelegyet 6 ml karbonát-formában levő DEAE-Sephadex-re visszük és 180 ml vízzel mossuk. Ezután a terméket 0,1 mólos trietil-ammónium-karbonát-pufferrel (pH= 7,5) eluáljuk. Az eluátumot vákuumban bepároljuk. Ezt követően a maradékot etanollal felvesszük, az etanolt elpárologtatjuk és ezt a műveletet néhányszor megismételjük. Ilyen módon 110 mg rezorufin-9- karbonsav-/j-D-galaktopiranozid-trietil-ammóniumsót kapunk. UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH= 7,5): X max = 465 nm, /?-galaktozidázzal végzett hasítás után: Amax= 570 nm. 12. példa Rezazurin-ff-D-galaktopiranozid 12,6 g rezazurin-nátriumsót 65 ml 1 n nátrium-hidroxid-oldatban és 80 ml vízben oldunk. Ehhez 150 ml kloroformban levő 20,6 g aceto-bróm-a-D-galaktózt és 18,2 g hexadecil-trimetil-ammónium-bromidot adunk. Ezt a keveréket 3 órán keresztül visszafolyatás közben forraljuk, majd szárazra pároljuk és a maradékot etil-acetáttal eldörzsöljük. Ezt az etil-acetátos oldatot ismét bepároljuk és az anyagot 500 g szilikagélen, melilén-diklorid —etil-acetát (3:1) eleggyel eluálva kromatografáljuk. Ilyen módon 2,13 g tetraacetil-rezazurin-/?-D-galaktopiranozídot kapunk, Rf= 0,5 (nagynyomású vékonyrétegkromatográfiával, a fenti futtatószerrel). Dezacetilezés céljából a 2,13 g tetraacetilszármazékot 0,1 g nátrium-metiláttal és 100 ml abszolút metanollal egy órán át szobahőmérsékleten keverjük. A kivált terméket leszívatjuk, majd vákuumban kalcium-klorid felett szárítjuk. A kitermelés: 1,0 g. Rf= 0,62 [magasnyomású vékonyrétegkromatográfia szilikagélen, etil-acetát —izopropanol —víz (9:4:2) futtatószerrel]. 'H-NMR (DMSO-d6): 6= 3,30-3,90 (m, 6H); 4,54 (széles, d, J = 4,4Hz, 1H); 4,67 (széles, t, J = 4,4Hz, 1H); 5,07 (d, J = 7Hz, 1H); 5,27 (széles, d, J =4,4Hz, 1H); 6,15 (d, J = 2Hz, 1H); 6,63 (dd, J =9,6 és 2Hz, 1H); 7,2 (m, 2H); 7,96 (d, J =9,6Hz, 1H); 8,07 (d, J =9Hz, 1H). 13. példa Rezorufin-9-karbonsav-metil-észter-q-D-galaktopiranozid 3,9 g pentaacetil-galaktózt 0,1 g vízmentes cink-kloriddal elegyítve 125 °C-ra hevítünk. Az anyagot 20 percig 1330 Pa nyomás alatt keverjük. Az olvadékhoz 1 g rezorufin-1-karbonsav-metil-észtert adunk, az elegyet ezután 1 óra 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
