198734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rezofurin szk-ok glikozidjainak előállítására, eljárás glikozidázok és szacharid láncokat hasító enzimek aktivitásának meghatározására és diagnosztikumok enzimek kimutatására
1 HU 198734 B 2 hosszat 41 °C hőmérsékleten keverjük, majd a 7. példában leírt módon szilikagélen kromatografáljuk, kloroform-etil-acelát (2:1) eleggyel. így sárga színű olajos anyag alakjában 25 mg letraacetil-rezorufin-9-karbonsav-metil-észter-a-D- galaktopiranozidhoz jutunk. Rf- 0,22 (nagy nyomás alatt végzett vékonyréteg-kromatográfia (HPTLC) szilikagélen, a fenti futtatószerrel}. A rezorufin-9-karbonsav-metil-észter-a-D-galaktopiranoziddá történő dezacetilezést a 10. példával analóg módon végezzük, így a cím szerinti vegyületel kapjuk. 14, példa Rezorufin-9-karbonsav-(3.6-dioxa-oktil)-ész-tcr-ff-D-galaktopiranozid 0,6 g tetraacetil-rezorufin-9-karbonsav-melil-észter-/í-D-galaktopiranozidot 50 ml dietilénglikol-monoetil-éterrel és egy spatulahegynyi nátrium-hidriddel elegyítünk és az anyagot 15 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd 100 ml acetont adunk hozzá. A kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük és szárítjuk-. A kitermelés: 56 mg rezorufin-9-karbonsav-(3,6-dioxa-oktil)-észter-/y-D-galaktopiranozid. Rf = 0,54 [nagy nyomás alatt végzett vékonyréteg-kromatográfia (HPTLC) szilikagélen, etilacetát — izopropanol (9:4) futtatószerrel]. 15. példa Rezorufin-maltoheptaozid Az amiláz (E. C. 2.4.1.19), például a Bacillus macerans-ból nyert amiláz hidrolizáló és ciklizá- Ió hatása mellett glikozil-átvivő tulajdonságokkal is rendelkezik, amit oligoszacharidok és oligoszacharid-származékok szintéziséhez ki lehet használni (Methods in Carbohydrate Chemistry, 11.347). 680 mg Bacillus macerans DSM 24 mikroorganizmusból nyert amilázt (liofilizátum: 0,46 E/mg bemérés: a bemérés proteintartalma: 28,5%), 500 mg rezorufin-glükozidot, 3,5 g alfa-ciklodextrint és 70 ml' Soerensen-féle foszfátpuffert (pSH 6,2:0,01 mólos) összekeverünk, majd ezt 24 órán keresztül 37 6C-on inkubáljuk. Tisztítás céljából ezután az alfa- és a keletkezett /?-ciklodextrint előbb a tetraklór-etilén-zárványvegyületen keresztül elválasztjuk. Térhálós szerkezetű dextránon (Sephadex LH20) végzett kromatografálás után 50 mg liofilizátumot állítunk elő, amely az amiláz-tesztben rendkívüli mértékben aktív rezoruíinil-maltoheptaozidból áll. R{- 0,83 [vékonyréleg-kromatográfia szilikagélen (Merck); futlatószer: metil-etil-keton-jégecet-víz 3:1:1 arányú elegye]. 16. példa /3-D-Galaklozidáz aktivitásának meghatározása a) Az alkalmazásra kerülő oldatok elkészítése: Pufferoldat: HEPES 100 mmól/1 Nátrium-klorid 154 mmól/1 Magnézium-L-aszpartát 2 mmól/1 RSA 10 g/1 Tween-20 0,5 g/1 pH-érték (nátrium-hidroxid-oldattal beállítva, 37°C) 7,3 1. számú reagensoldat A fentiekben leírt pufferoldatban feloldunk 0,8 mmól/1 rezorufin-/t-D-galaktopiranozidot. 2. számú reagensoldat A fentiekben lírt pufferoldatban feloldunk 3,5 mmól/1 rezorufin-9-karbonsav-/?-D-galaktopiranozidot. 3. számú reagensoldat A fentiekben leírt pufferoldatban feloldunk 1,0 mmól/1 rezorufin-9-karbonsav-metil-észter>p-D-galaktopiranozidot. Enzimoldat A fentiekben leírt pufferoldatban Escherichia coli-ból származó /v-D-galaktozidázt oldunk úgy, hogy az oldat aktivitása — a gyártó által megadott adatok alapján — kb. 0,08 U/ml legyen. Az enzim a kereskedelemben beszerezhető készítmény. b) Mérési módszer A mérést fotometrikus eljárással végezzük, 579 nm hullámhosszon. 1 cm-es küvettában 950 fii reagensoldatot és 50 fii enzimoldatot 37 °C-on összekeverünk. A reakciót úgy mérjük, hogy meghatározzuk az extinkció növekedését időegységenként [mExt/ /min]. Ezt úgy számítjuk ki, hogy a mért extinkciós értéket osztjuk a reakcióidővel. \ fenti mérések során talált értékeket az alábbi Táblázatban foglaljuk össze: Reagensoldat száma Reakció [mExt/min] 1. 85 2. 46 3. 76 17. példa P-D-Galaktozidáz kimutatása indikátorfilm segítségével Homogén masszát készítünk az alábbi anyagokból: 5 ml 7,3 pH-jú vizes oldat, amely 0,5 mól kálium-foszfátot és 0,05 mól magnézium-kloridot tartalmaz, 0,13 g nátrium-alginát, 8 g 50%-os poli(vinil-propionát)-diszperzió, 11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 /
