198734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rezofurin szk-ok glikozidjainak előállítására, eljárás glikozidázok és szacharid láncokat hasító enzimek aktivitásának meghatározására és diagnosztikumok enzimek kimutatására
1 HU 198734 B 2 10 g szilikagél, 12 ml víz, 0,4 g Triton X-100, 50 mg rc7orufin-/í-D-galaklopiranozid, 5 ml metanolban oldva. Ezt a maszát felvisszük egy 0,1 mm vastagságú polikarbonál-fóliára (Pokalon, Lonza cég) 0,2 mm szélességű sávokban. A rávitt anyagot ezután 50 °C hőmérsékleten megszárítjuk, majd a fóliát bxó mm-es darabokra vágjuk, végül ragasztószalaggal 400 pm. vastagságú polisztirol-fóliára felragasztjuk. Az így kapott tesztcsíkokat rövid időre belemártjuk a ^-D-galaktozidázt tartalmazó vizsgálandó oldatba. Kél perc várakozási idő után, szobahőmérsékleten vörös elszíneződése lép fel, melynek intenzitása a vizsgált oldat /3-D-galaktozidáz-koncentrációjától függ. Meghatározott és ismert /?-D-galaktozidáz-tartalmú tesztoldatok segítségével egy színskálát állíthatunk fel és ennek felhasználásával egy próba ismeretlen ß-D-galaktozidáz-tartalmát meg lehel határozni. A fentiekben leírt tesztcsíkokat arra is fel lehet használni, hogy valamilyen minta /3-D-galaktozidáz-aktivitását kinetikusán — reflexiófotometriás úton — meghatározzuk. Ennek érdekében a szokásos módon, vagyis ismert mértékű ß-D-galaktozidáz-aktivitást tartalmazó próbák alapján, egy hirdetési görbét veszünk fel. A hitelesítési görbe segítségével azután meg lehet határozni egy bármilyen minta még nem ismert ß-D-galaktozidáz aktivitását. 18. példa Szabad és konjugált /7-D-galaktozidáz aktivitásának meghatározása a) Az alkalmazásra kerülő oldatok elkészítése: Pufferoldat: HEPES 100 mmól/1 Nátrium-klorid 154 mmól/1 Magnézium- L- aszpartát 2 mmól/1 BSA 10g/l Tween-20 0,5 g/1 pH érték (nátrium-hidroxi-oldattal beállítva, 37°C) 7,3 Reagensoldat A fentiekben leírt pufferoldatban feloldunk 0,8 mmól/1 rezorufin-/?-D-galaktopiranozidot. Enzimoldat A fentiekben leírt pufferoldatban Escherichia coli-ból származó /?-D-galaktozidázt oldunk úgy, hogy az oldat aktivitása - a gyártó által megadott adatok alapján - kb. 0,08 U/ml legyen. Az enzim a kereskedelemben beszerezhető készítmény. Enzim-konjugátum-oldat Egy /t-D-galaktozidáz-antitest-készítményt használunk. Az ilyen enzim-antite&t-konjugátumok előállítása ismert, így például a Biochem. Biophys. Acta, 612, 40 — 49 (1980) irodalmi forrásban ilyen eljárás leírása található. A készítményt pufferoldatlal hígítjuk olyan mértékben, hogy annak aktivitása a fentiekben leírt enzimoldatával nagyjából megegyező legyen. b) Mérési módszer A mérést fotometrikus eljárással végezzük 578 nm hullámhosszon. 1 cm-es küvettában 950 pl reagensoldatot 37 “C hőmérsékleten összekeverünk 50 pl enzimoldattal, vagy pedig 50 pl enzim-konjugátum-oldattal. A reakció mértékeként meghatározzuk az időegységenként bekövetkező extinkciónövekedésl [mExt/min], A szabad /?-D-galaktozidázzal végzett reakciónál 85 mExt/min értéket, míg a /?-D-galaktozidáz-antilest-konjugátummal végzett reakció esetén 92 mExt/min értéket mértünk. Mind a két mért érték azt mutatja, hogy mind a szabad, mind a konjugált /?-D-galaktozidáz esetében jól mérhető extinkciós különbség van. Ebből következik, hogy az ismertetett vegyületek szubsztrátumként a szabad glikozidázokhoz és a glikozidázkonjugátumokhoz egyaránt alkalmasak. Az új szubsztrátumokat tehát nemcsak a szabad glikozidázok meghatározásához lehet diagnosztikai készítményként hasznosítani, hanem azokat előnyös módon olyan immunológiai meghatározási módszerekhez is felhasználhatjuk, melyeknél valamilyen glikozidáz az indikátorenzim szerepét tölti be. 19. példa o-Amiláz-aktivitás meghatározása Citrátpufferben (pH = 6) oldott rezorufin-maltoheptaoziddal ( előállítását lásd a 15. példában) szűrőpapírt itatunk át. Az így kapott reagenspapírt egymás után egy a-amilázt tartalmazó, majd egy a- és 0-glüközidázt tartalmazó próbaoldatba mártjuk. Néhány perc múlva igen jól látható vörös elszíneződés lép fel, melynek intenzitása a próba a-amiláz- koncentrációjával arányos. Az a-amilázt ismert koncentrációban tartalmazó próbák segítségével egy hitelesítő görbét tudunk felvenni és ennek alapján egy minta ismeretlen a-amiláz-tartalmát meg lehet határozni. A fenti 15 -19. példában használt rövidítések jelentése az alábbi: HEPES 2-[4-(2-hidroxi-etil)-l-piperazinil]-etán-szulfonsav, BSA szarvasmarha-szérumból kinyert albumin (bovine serum albumine), Tween - 20 polioxietilén(20)szorbitán-monolaurát, Triton X 100 alkilfenol-polielilénglikol-éter. 20, példa a) Pe racetil- ff- D-maltopentaozid 100 g (0,12 mól) maltopentaózt és 81,8 g (1,0 mól) vízmentes nátriumacetátot 1,1 liter (11,7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
