198627. lajstromszámú szabadalom • Eljárás granulocita telepstimuláló faktort tartalmazó stabil gyógyászati készítmény előállítására
10 HU 198627 B Módosított McCoy 5A tenyésztő oldat (dupla koncentráció) 12 g McCoy 5A tenyésztő oldatot (Gib— co), 2,55 g MÉM aminosav-vitamin tápközeget (Nissui Seiyaku Co., Ltd.), 2,18 g nátrium-hidrogén-karbonátot, és 50 000 egység kálium—G—penicillint feloldunk 500 ml kétszer desztillált vízben, és az oldatot aszeptikusán szűrjük Millipore szűrőn keresztül (0,22 m). 9 ban mutatjuk be. Az .aktivitás (%)' kifejezés a táblázatban a G-CSF maradék aktivitásét képviseli a kiindulási egységre vonatkoztatva, és ezt következő képlettel határozzuk 5 meg: aktivitás egység egy adott idő eltelte után Aktivitás (%) = ----------------------------——— x 100 kiindulási aktivitás- 10 egység (b) Fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadék kromatográfia Fordított fázisú C8 oszlopot (4,6 mm x x 300 mm; 5 m) és mozgó fázisként n-propanol/trifluor-ecetsav keveréket alkalmazva a G-CSF maradék aktivitását (1 jug-ma! ekvivalens mennyiségben injektálva) a következő grádiens-körülmények közt határozzuk meg: Idő (sec) (A) Oldószer (B) Oldószer Grádiens 0 100% 0% 1 lineáris 15 0% 100% \ lineáris 25 100% 0% J lineáris Valamely stabilizálószert tartalmazó G-CSF-et tartalmazó oldatot steril, szulfa-kezelt üvegfiolába helyezünk, -40 °C vagy als- 15 csonyabb hőmérsékleten fagyasztjuk 4 órán ót, a szárítás első lépésében a hőmérsékletet 48 óra alatt -40 °C-ról 0 °C-ra emeljük, eközben 4 Pa-ról 13 Pa-ra növelve a nyomást n ajd a második lépésben 12 óra alatt 0 °C- 20 -vól 20 °C-ra emeljük a hőmérsékletet, eközben a nyomóst 13 Pa-ról 35 Pa-ra növeljük, ez után a fiola belsejét steril száraz nitrogéngázzal töltjük meg, hogy atmoszférikus nyomást érjünk el, és a fiolát fagyasztva- 25 -szárító gumidugóval ledugaszoljuk, majd alumínium kupakkal lezárjuk. 1. TÁBLÁZAT (A) oldószer: 30% n-propanol és 0,1% trifluor-ecetsav (B) oldószer: 60% n-propanol és 0,1% trifluor-ecetsav A kimutatást 210 nm hullámhossznál végezzük, és a maradék G-CSF aktivitásának százalékát a következő képlettel számítjuk ki: a G-CSF maradék mennyisége egy adott idő eltelte Maradék után G-CSF aktivitás% = ------------------------------- x 100 a G-CSF kiindulási mennyisége A G-CSF ezzel a módszerrel meghatározott maradék mennyisége nagyon jól egybevág az egér csontvelő-sejteket alkalmazó lágy agar (a) módszerrel végzett mérésben elért eredményekkel. 1. példa 5 ug G-CSF-hez az 1, táblázatban felsorolt stabilizáló szerek egyikét adjuk, és a keveréket aszeptikusán oldjuk 20 mmól/1 pufferoldatban (amely 100 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmaz; pH 7,4) hogy 5 ug G-CSF/ml-t tartalmazó gyógyászati készítményt állítsunk elő, amelyet azután fagyasztva szárítunk. A G-CSF aktivitásának változását az idő függvényében az (a) módszerrel mérjük, és az eredményeket az 1. táblázat-Stabilizázálószer Mennyiség Aktivitás (%) (tömegrész) 4 °C hőmérsékleten 6 hónapon ót végzett tárolás után 37 °C hőmérsékleten 1 hónapon át végzett tárolás után xilit 10 000 92 86 mannit 10 000 91 85 glűkuronsav 10 000 86 82 hialuronsav 2000 92 89 dextrán (molekulatömeg: 40 000 2000 95 90 heparin 5000 85 80 kitozán 2000 93 91 alginsav 2000 90 90 humán szérum albumin 1000 98 99 7
