198570. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vérplazma tromboxán B2 tartalmának radioimmunológiai meghatározására
5 HU 198570 B 6 A kalibrációs görbe készítéséhez szükséges TXBz-mentes vérplazmát célszerűen a mérendő mintákkal faj-azonos vérplazmából készítjük, olyan módon, hogy a plazmában lévő TXB2-t aktív szénnel, előnyösen csontszénnel megkötjük, majd a csontszenet centrifugálással eltávolítjuk. Az ismert koncentrációjú standard oldatokat RIA-pufferben való hígítással állítjuk elő. Ebben az esetben a TXB2-mentes vérplazmát a mérendő mintákkal azonos térfogatban hozzáadjuk a standardokat tartalmazó reakcióelegyhez. Ez a módszer azonos a találmányi leírás példájában ismertetésre kerülő kiviteli móddal. Eljárhatunk úgy is, hogy magából a TXBí-mentes vérplazmából készítünk ismert mennyiségű TXBz hozzáadásával standard higitási sorozatot. Ebben az esetben a hatóanyagmentes plazmát nem szükséges külön lépésben adni a reakcióelegyhez. A kötött illetve nem-kötött radioligand-frakciók elválasztására 0,01-1 mólos, előnyösen 0,01 mólos, előnyösen 7,4 pH-jú - 0,05- -IX, előnyösen 0,5% dextránt tartalmazó - foszfát puffer-oldatot alkalmazunk, melyben 0. 1.3%, előnyösen 1% csontszenet szuezpendálunk. Ez a reagens a reakcióelegyben lévő szabad radioligandumot megköti, és a centrifugálás után kapott felülúszó tartalmazza az antitesthez kötött radioligandot. Az antitesthez kötött radioligand radioaktivitásét szcintillációs módszerrel megmérjük, a radioaktivitás-értékekből, a specifikus kötések értékeiből, valamint a standard koncentrációkból a RIA ismert számítási elve szerint készítjük a kalibrációs görbét, és számítjuk a vérplazma-minták TXBü-tartalmát. A számításokat célszerűen számítógép segítségével végezzük, a kalibrációs görbét pedig előnyösen lineáris transzformációval, előnyösen logit - log illesztéssel készítjük. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: 1. Lehetővé teszi vérplazma TXBz-tártál mának közvetlen radioimmun meghatározását, és ily módon elkerülhetővé válik a vérplazma hosszadalmas, munkaigényes és költséges tisztítása. 2. Lehetővé teszi jód-125 izotóppal jelzett, nagy fajlagos aktivitású tromboxán B2- -monojód-tirozin-metilészternek a fenti meghatározáshoz való alkalmazását, és ezzel a jódizotópnak a tricum-izotóphoz viszonyított elvi (nagyobb érzékenység) és gyakorlati (gyors és olcsó méréstechnika) előnyeinek kiaknázását. 3. Mindezen előnyöket úgy éri el, hogy a meghatározáshoz szükséges alapreagenseket változatlanul felhasználja, és a hagyományos radioimmun meghatározás valamennyi előnyét megőrzi. A találmány szerinti eljárást az alábbi példán ismertetjük, amelyre az eljárás oltalmi köre természetesen nem korlátozódik: Példa Humán vérplazma TXBi-tartalmának radioimmun meghatározása 3 ng/ml koncentrációjú, 0,05 móloB, 7,4 pH-jú, 0,1% zselatint tartalmazó foszfát pufferben (RIA-puffer) készült TXB2 tórzsoldatból higitási sorozatot készítünk úgy, hogy 0,4-0,4 ml térfogatú és 12-37-111-333-1000 pg/ml koncentrációjú TXBz oldat-mintákat kapjunk, és ezekből 0,1-0,1 ml-t sorszámozott műanyag kémcsövekbe automata pipettával bepipettázunk. Ezután ugyanezen csövekbe valamint a mintáknak számozott csövekbe bepipettázunk 0,1-0,1 ml térfogatú RIA-pufferben oldva kb. 30 000 cpmm beütésszámú 125i_txB2-TME radioligandot (MTA Izotóp Intézete, Budapest terméke), specifikus antitestet olyan hígításban, hogy a Bo/T érték 30-50% legyen, és ugyancsak 0,4%-os ANS oldatot pipettázunk. Ezután a standard hígításokat tartalmazó kémcsövekbe 0,1 ml TXBr-mentes plazmát, míg az ismeretlen minták méréséhez számozott kémcsövekbe 0,1 ml vérplazmát mérünk, és valamennyi kémcső tartalmát RIA-pufferrel 0,4 ml térfogatra egészítjük ki, majd kémcsókeverővel néhány másodpercig kevertetjük. Minden ismert és ismeretlen mintából három párhuzamos meghatározást végzünk. A nem-specifikus kötődés (NSB) meghatározáséra további három kémcsőbe az antiszérum helyett 0,1 ml RIA-puffert, a 0-standard (Bo/T érték) mérésére a standard oldatok helyett 0,1 ml RIA-puffert pipettázunk a radioligand, ANS-oldat és a hatóanyagmentes plazma mellé. A O-standarddal azonos összetételű további három mintából a teljes radioaktivitást (TC) határozzuk meg. A standard higitási sorozattal együtt alkalmazott TXB2-mentes plazmát normál humán vérplazmából készítjük úgy, hogy ahhoz 2% csontszenet (Norit-A; Serva, NSZK) adunk, ezzel szobahőmérsékleten 20 percig kevertetjük, majd 20 percig 2000 x g gyorsulással centrifugáljuk. A felülúszót leöntjük, és ezzel a centrifugálást az előbbiek szerint megismételjük. Az ismeretlen vérminták meghatározásához szükséges plazmamintákat úgy kapjuk, hogy a paciensektől a vért műanyag kémcsövekbe gyűjtjük 10 térfogatrész vérre számítva 1 térfogatrész izotóniés sóoldatra (pH 7,4), amely 2% etilén-diamin-tetraecetsav-dinátriumsót és 1 mmól/l koncentrációjú indometacint tartalmaz. A levett vért azonnal centrifugáljuk 4 °C-on 10 percig 1000 x g gyorsulással, majd a plazmát elválasztjuk. A kevertetés befejezése után a kémcsöveket hűtőszekrényben 4 °C körüli hőmérsékleten egy éjszakán ét állni hagyjuk, majd a TC csövek kivételével minden csőbe folyamatos keverés közben 2-3 perc alatt bepipettázunk 0,5 ml csontszén-Bzuszpenziót. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
