198570. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vérplazma tromboxán B2 tartalmának radioimmunológiai meghatározására
3 HU 198570 B 4 maga a RIA meghatározás is lehetetlenné vélik (Mucha I.: Kandidátusi értekezés, Budapest, 1985). Ennek következtében a technika jelen állása mellett nem ismerünk olyan módszert, amelynek segítségével a 125I-TXB2-TME radioligandon alapuló RIA felhasználható volna a vérplazma TXB2 koncentrációjának direkt radioimmun meghatározására. A találmány célja ilyen eljárás kidolgozása. A találmány szerinti eljárás tehát az ismert módszerektől abban különbözik, hogy a vérplazma TXB2 koncentrációjának közvetlen radioimmun meghatározását 125I-TXB2-TME radioligandon alapuló RIA módszerrel végzi, a találmány szerint előnyösen annak révén, hogy ezen radioligandnak a plazmafehérjékhez való kötődését 8-anilin-l-naftalin-szulfonsavval gátolja, A találmány alapja az a felismerés, hogy a l25I-TXB2-TME származék szerkezetileg analóg a természetes tiroxinnal, és ez az analógia az oka a plazmafehérjékhez való kötődésének. Ismert, hogy a természetes tiroxint a vérplazma globulin frakciójában található tiroxin binding globulin (TBG) nagy affinitással köti, és tapasztalati tény, hogy 8-anilin-l-naftalin-BZulfonsavval (továbbiakban ANS) ez a kötés gátolható (Rational Diagnosis of Thyroid Disease; Proceedings of the Bernstein Workshop, Ed. R. Höfer, Verlag H. Engermann, 1977, Vienna, Austria, 53-79 oldal). Felismertük, hogy a szerkezeti analógia alapján az ANS nemcsak a tiroxin, hanem a 125I-TXBz-TME radioligand kötődését is gátolja. Ennek eredményeképpen a radioligandnak specifikus antitesthez való kötődése plazmafehérjék jelenlétében sem gátolt, és igy a 1Z5I-TXB2-TME radioligand alkalmassá válik a vérplazma TXB2 tartalmának direkt radioimmun meghatározásában való felhasználásra. A találmány tárgya tehát eljárás vérplazma tromboxán B2 (továbbiakban TXB2) tartalmának radioimmunológiai (antigén-antitest reakción alapuló) meghatározására, melynek során megmérjük radioizotóppal jelzett nyomjelző vegyület (továbbiakban radioligand) specifikus antitesttel való kötődésének változásét ismert TXB2-koncentrációjú standard hígitási sorozat, illetve az ismeretlen minták jelenlétében, majd a standard hígitási sorozat és a hozzájuk tartozó kötésváltozások alapján kalibrációs görbét készítünk, és az ismeretlen koncentrációkat az általuk okozott kótésváltozások függvényeként a kalibrációs görbéből meghatározzuk, olyan módon, hogy radioligand ként (I) képletű jód-125 izotóppal jelzett, nagy fajlagos aktivitású tromboxán B2-monojód-tirozin-metilészter származékot alkalmazunk, amelyet a specifikus antitesttel 8-anilin-l-naftalin-szulfonsavat tartalmazó puffer-oldatban reagáltatunk egyrészt a standard TXB2-oldatokkal az ismeretlen mintákkal faj-azonos, TXBz-t nem tartalmazó vérplazma jelenlétében, másrészt az ismeretlen vérplazma-mintákkal. Ennek során úgy járunk el, hogy a RIA méréshez előkészítjük a meghatározandó plazma-mintákat, oly módon, hogy a kísérleti alanyokból vért veszünk olyan kémcsövekbe, amelyek alvadáagátló anyagot, és TXB2-szintézisgátló anyagot tartalmaznak, majd a vért hidegen tartva azonnal centrifugáljuk, és a vérplazmát elválasztjuk. Ezután a radioligandot és a specifikus antitestet ANS-t tartalmazó vizes puffer-oldatban reagáltatjuk egyrészt a hígitási sorozat szerint különböző mennyiségű inaktiv TXBz-vel TXBí-t nem tartalmazó vérplazma jelenlétében, másrészt a meghatározandó vérplazma-mintákkal, majd elválasztjuk az antitesthez kötött, illetve az antitesthez nemkötött frakciókat, és mérjük a kötött frakciók radioaktivitását. A radioaktivitás-adatokból kiszámítjuk a specifikus kötések értékeit, és a standard hígítás koncentrációinak függvényében kalibrációs görbét készitünk az ismert eljárások szerint, majd az ismeretlen koncentrációkat a kalibrációs görbe alapján kiszámítjuk. A vér-minták gyűjtésénél véralvadásgátló anyagként előnyösen etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA), előnyösen annak dinátriumsóját, alkalmazunk, a TXB2-szintézis gátlására előnyösen indometacint használunk. Az EDTA-t előnyösen 0,2%-os, az indometacint pedig előnyösen 0,1 mmój/l végkoncentrációban alkalmazzuk. A vért műanyag, előnyösen polipropilén anyagú kémcsőbe gyűjtjük, amelyet a vérvétel közben jeges vízfürdőben tartunk. A centrifugálást a gyűjtés után a lehető legrövidebb idő alatt elvégezzük, előnyösen 0 °C körüli hőmérsékleten. Az oldat összetételétől függően az inkubációs hőmérséklet 0 °C és 40 °C, előnyösen 0 °C és 8 °C között, az inkubáció időtartama 1 óra és 40 óra, előnyösen 3 óra és 20 óra között változik. Általában 10 000 és 60 000, előnyösen 20 000 és 40 000 cpm közötti beütésszámú radioligandot alkalmazunk, célszerűen vizes puffer-oldatban. A puffer előnyösen 0,1% zselatint tartalmazó, 0,01-0,2, előnyösen 0,05 mólos, 7,4 pH-jú vizes foszfát puffer (RIA-puffer). Az ANS-t RIA-pufferben oldjuk olyan töménységben, hogy annak végkoncentrációja az inkubálás során, a hígulés figyelembevételével 0,01-0,5%, előnyösen 0,1% legyen. A specifikus antitest célszerűen magas titerű, megfelelően magas affinitási együtthatójú, előnyösen nyúlból előállított anti-TXB2- -immunsavó, melynek hígítását úgy választjuk meg, hogy a radioligand 20-80%-a, előnyösen 40-50%-a kötődjön az antitesthez abban a mintában, amely inaktiv TXBz-t nem tartalmaz (0-standard vagy Bo/T). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
