198570. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vérplazma tromboxán B2 tartalmának radioimmunológiai meghatározására
1 HU 198570 B 2 A találmány tárgya eljárás vérplazma tromboxán B2 (továbbiakban TXBz) tartalmának radioimmunológiai (antigén-antitest reakción alapuló) meghatározására, melynek során megmérjük (I) képle tű, nagy fajlagos aktivitású, jód-125 izotóppal jelzett tromboxán B2- -tirozin-metilészter származék (továbbiakban U5I-TXB2-TME) specifikus antitesthez való kötődésének változását ismert mennyiségű TXB2 higitási sorozat, hatóanyagmentes plazma és a meghatározandó minták jelenlétében, majd a plazmaminták által okozott kötődésváltozás alapján kiszámítjuk azok hatóanyag-tartalmát. Ezen meghatározás a vérplazma előzetes tisztítása nélkül, direkt módszerrel történik, mely a találmány szerint azáltal lehetséges, hogy a radioligandnak a plazmafehérjékhez való kötődését 8-anilin-l-naftalin-szulfonsavval gátoljuk. Ismert, hogy a tromboxán A2 a véralvadási folyamat egyik fontos faktora, amelyet a vérlemezkék nagy mennyiségben termelnek, és ennek vérplazmában mért koncentrációja számos véralvadással összefüggő normális vagy kóros folyamat indikátora. Éppen ezért a sokféle biológiai közeg közül leggyakrabban a vérplazma TXA2 tartalmának meghatározása a cél. Mivel a hatásos anyag biológiai közegben néhány másodperc felezési idővel TXB2-vé alakul át, a TXA2 mennyiségének meghatározása a kémiailag stabilis TXB2 mérésével történik. A technika mai állása mellett a TXB2 koncentráció mérésének legelterjedtebb módja a .radioimmun meghatározás (radioimmunoassay, továbbiakban RIA), amelyhez a TXB2- -nek radioizotóppal, mégpedig vagy triciummal, vagy jód-125 izotóppal jelzett származékait alkalmazzák radioligandként [Prostaglandins 12, 929 (1976), Anal. Biochem 82, 1 (1977), Anal. Biochem. 87, 343 (1987)]. A TXB2 RIA meghatározások - más RIA módszerekhez hasonlóan - a mérendő biológiai minták RIA meghatározás előtti feldolgozása szempontjából két csoportba sorolhatók: az egyik változat szerint a mintából előzetesen el kell távolítani mindazon szennyezőket, amelyek a meghatározást zavarják, míg a másikban ez a művelet elmarad. Az első módszer különféle változataiban az előzetes tisztítás általában oldószeres extrakcióból és esetenként azt követő kromatográfiás elválasztásból áll (ún. extrakciós módszerek), míg a második esetben a plazma feldolgozás nélkül kerül mérésre (ún. direkt módszer). A kétféle módszert összehasonlítva megállapítható, hogy a2 extrakciós eljárások jelentős elvi és gyakorlati hátrányokat mutatnak a direkt módszerhez képest. Az extrakciós eljárásoknak a Prostaglandins and Related Substances - a Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1987, pp. 167- -197) című szakkőnyben részletesen tárgyalt elvi hátrányai körül kiemelendő, hogy az amúgyis alacsony koncentrációban jelenlévő hatóanyag számottevő hányada elvész a feldolgozás során, emiatt gyakran nehézséget jelent a méréshez szükséges érzékenység biztosítása. Külön hátrány, hogy az extrakció következtében olyan szennyeződések is feldúsulhatnak, amelyek a RIA meghatározás specifikusságát rontják. Az extrakciós módszer hátrányainak másik köre gazdasági jellegű. Ismert, hogy még a technika mai állása mellett legkorszerűbbnek számító szilárd fázisú extrakció [Prostaglandins, 20, 947 (1980)] is 1 ml vérplazma-minta feldolgozásához 50 ml szerves oldószert és 1 db 2 .f értékű, egyszeri felhasználásra alkalmas mintaelőkészítő patront igényel. Gyakorlott laboratóriumi asszisztens egy munkanapon 30-40 minta feldolgozását képes elvégezni, ugyanakkor a tulajdonképpeni radioimmun meghatározás 100 cső esetében csak mintegy 3 óra élőmunkát igényel. Mindezen adatok egyértelműen bizonyítják, hogy az extrakciós RIA-módszernek direkt eljárással való helyettesítése a TXB2 tartalom radioimmun meghatározásában mind elvi, mind pedig gyakorlati szempontból alapvető fontosságú és indokolt célkitűzés. Tapasztalati tény, hogy a triciummal jelzett TXBz radioligandnak specifikus antitesttel való kötődése plazmafehérjék jelenlétében is megfelelően végbemegy, ily módon a vérplazma TXB2-tartalmának direkt radioimmun meghatározása elvileg lehetséges ezen radioliganddal. Tapasztalati tény azonban az is, hogy a normál vagy annál alacsonyabb plazma-koncentrációk mérésére a triciummal jelzett radioligandon alapuló RIA nem elég érzékeny. Éppen ezért feltétlenül célszerű és indokolt egy érzékenyebb módszer alkalmazása. Az érzékenység tekintetében elméletileg kedvező a jód-125 radioizotóppal jelzett radioligand alkalmazása, mivel ismert, hogy az ezzel elérhető fajlagos aktivitás akár tízszerese is lehet a triciummal elérhető fajlagos aktivitásnak, és ennek megfelelően a RIA meghatározás érzékenysége is növekszik. Jód-125 izotóppal jelzett radioligandként ismert vegyület az (I) képletű tromboxán B2- -monojód-tirozin-metilészter (továbbiakban 125I-TXB2-TME) [Anal. Biochem. 87, 343 (1978)]. Ezt az anyagot elterjedten használják a TXB2 RIA meghatározásban, sőt kereskedelmi forgalomban lévő mérőkészletekben is. Előnye elsősorban abban áll, hogy segítségével valóban jelentősen nagyobb érzékenység érhető el, mint a triciummal jelzett radioliganddal [Methods Enzymol. 86, 297 (1982)]. Tapasztalati tény viszont, hogy a 125I-TXB2-TME radioliganddal elért nagyobb érzékenység a vérplazma TXB2 tartalmának direkt RIA mérésében nem hasznosítható, mivel a vérplazma fehérjéi ezt a radioligandot nagy affinitással kötik, így a specifikus antitesthez való kötődése gátolt, és ezáltal 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
