198514. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteinek renaturálására
1 2 c) A hajtogatott intermedier képződéséig eltelő idő nieghatarozása- A fentiek szerinti denaturálás/renaturálás útján 25 °C-on meghatározzuk a savdenaturált LDH-MU «aktiválódásának kinetikáját 0,01 mg/ml protein-koncentrádónál. Az eredményt a 4. ábra mutatja. d) Savdenaturált LDH-M4 folyamatos reaktiválása Egy zárt reaktorba folyamatosan savdenaturált LDH-M4-et és reaktiváló puffert táplálunk be. Az alkalmazott reaktiváló re.aktort vázlatosan az 5. ábrán mutatjuk be. Az A és B tárolóedényekből a Pl és P2 szivattyúkkal folyamatosan tápláljuk az enzim oldatát és a denaturáló oldatot, és a VI keverőszakaszban denaturálunk. A denaturált enzim-oldatot folyamatosan a V2 renaturáló reaktorba vezetjük be. Egyidejűleg a C tárol óedény bői a P3 szivattyú segítségével folyamatosan renaturáló oldatot táplálunk be ugyancsak a V2 reaktorba. A renaturált oldatot folyamatosan elvezetjük, és frakciószedőben gyűjtjük. Az oldatok összetétele és a reaktorban fennálló körülmények a ''lcövc tícc zőlc * A; 7,43 mg/ml LDH-M, 0,1 mól/1 7,6 pH-jú kálium-foszfát * 1 mmól/1 DTE + 1 mmól/1 EDTA elegyben 0 °C-on. B; Denaturáló puffer: 0,1 mólos foszforsav-oldat 0°C-on. C: Renaturáló puffer: 0,1 mól/112,6 pH-jú kálium- Toszfát ♦ 1 mmól/1 DTE ♦ 1 mmól/1 EDTA elegy 25 °C-on (a B-vel való elegyítés után a pH 7,6). VI: A Vl= 0,25 ml denaturálási térfogat 0 °C-on 3 perces denaturálási időtartamot eredményez. V2: A V2 renaturálási térfogat* 58 ml, 25 °C. Szivattyúsebesség: Pl= 1 ml/óra P2= 4 ml/óra P3= 10 ml/óra Az adott reaktornagyság/szivattyúsebesség aránynál egy molekulának a reaktorban való átlagos tartózkodási idejére 2,9 óra adódik. A működtetéskor 2,5 ml-es mintákat gyűjtünk, és a végső «aktiválást 24 óra 25 °C-on való állás után határozzuk meg. A 6. ábra a reaktor feltöltésekor mért aktivitásnövekedést mutatja. Mintegy 4 óra elteltével konstans «aktiválási kitermelést érünk el. A «aktiválás végkoncentrádóia: 0,5 mg/ml Kitermelés folytonos «aktiválás: 10,2 lU/mg összehasonlítás adagolás nélkül: 1,9 IU/mg A fenti eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerint mintegy 5,4-szer magasabb kitermelést érünk el, mint ugyanilyen végkonoentrádónál végzett direkt «aktiválással. 3. példa rec-tPA adagolásos reaktiválása a) A „törmelék testek" (refractile bodies, RB) előkészítése A sejtfeltárással és különböző centrifugálási/mosási műveletekkel végzett ,.RB"-preparálás az EP-A1-0114 506. számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés 7. példája szerinti eljáráshoz hasonlóan történik. Az ,,RB"-kben levő tPA idegen proteinnel szennyezett, inaktív és oldhatatlan. Szolubilizálás redukdó/denaturálás útján:- 2,5 g sejtből származó ,,RB”-ket 3 óra hosszat inkubálunk 25 °C-on 10 ml 0,1 mól/1 8,6 pH-jú TR1S/ /HC1 + 6 mól/1 guanidin . HCI * 1 mmól|lEDTA + 150 mmól/1 DTE elegyben. — összprotein az „RB"-kben redukdó után: 41,5 mg. A pH-t tömény sósavval 3-ra állítjuk, és Sephadgx G25F-en (oszloptérfogat- 270 ml) gélszűrést végzünk 0. 01 mólos sósav-oldatban. B) A «aktiválás koncentrádó-függésének meghatározása A redukált protein savas frakdóját maximális reaktiválhatósággal (c= 0,83 mg/ml) reoxidáljuk 1:3— -1:500 hígítással. A különböző hígításoknál történő reoxidálási körülményeket konstansra állítjuk be: 0,1 mól/1 10,4 pH-jú TR1S/HG ♦ 1 mmól/1 EDTA ♦ 0,5 mól/1 L-arginin ♦ 1 mg/ml BSA (benzol-szulfonsav)+ 1 mmól/1 GSH ♦ 0,2 mmól/1 GSSG elegy. Az aktivitást 25 °C-on 25— -27 órás reoxidálás után határozzuk meg. Az aktiválás mérése előtt reoxidádós pufferral azonos végkoncentrádóra állunk be. Az eredményeket az 1. táblázat és a rajzmelléklet 7. ábrája mutatja. 1. táblázat rec-tPA «aktiválásának koncentrádófüggése Protein -koncé ntrádó (pg/ml) 1 ^ Kitermelés 2) Stimulálhatóság (faktor) 277 31,3 16,8 138 52,4 17,0 92,2 64,9 18,5 55,3 74,9 21,5 27,7 91,5 17,5 17,3 95,6 25,3 8,68 100,0 20,5 5,53 97,8 19,8 3,95 94,4 20,6-JL84____________ 85.3 16,7 1) Protein-koncentrádó a «aktiválásnál (összprotein). 2) Maximális reaktiválási értékre vonatkoztatva. c) A «aktiválás kinetikájának meghatározása — Redukdót/reoxidádót hajtunk végre az előbb leírtak szerint. Az anyag szennyezettsége miatt a hajtogatott intermedier képződéséig eltelő időt közbetlenül nem lehet mérni, hanem közvetve a «aktiválás kinetikáján és az adagolási sebesség változtatásán keresztül körülbelül 40-60 percnek határozzuk meg. A 8. ábra mutatja a rec-tPA «aktiválásának kinelikáját 20 °C-on, 15 Mg/ml összprotein-koncentrádónál. A «aktiválás a 30 óra utáni végkitermelésre vonatkozik. d) rec-tPA „adagolásos «aktiválása" 2 perc és 45 perc közötti időintervallumokban 15 alkalommal egyenként 10 pl redukált ree-tPA-t adunk 0,01 mólos sósavban oldva, 300 pl «aktiváló pufferhoz 25 °C-on. — Reaktiválási puffer az adagolásos «aktiválás előtt: 0,15 mól/1 10,5 pH-jú TR1S/HG ♦ 1,5 mmólfl 198.514 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
